張慶 茹慶國 林紅梅 劉艷 康倩 李輝 吳清

中藥當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv．)Diels．的干燥根，有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效［1］，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，素有“十方九歸”之稱。當(dāng)歸揮發(fā)油是當(dāng)歸的主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究證明其有提高免疫力、消炎鎮(zhèn)痛和抗血小板聚集等作用［2-3］。

在本研究中，用分子蒸餾對超臨界流體萃法取制備的當(dāng)歸揮發(fā)油進(jìn)行進(jìn)一步分餾，應(yīng)用氣質(zhì)聯(lián)用色譜(gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS)分析所得餾分的化學(xué)組成，用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型評價(jià)各餾分的抗炎作用，用PLSR分析各餾分中的化學(xué)成分與抗炎藥效的相關(guān)性。本研究為當(dāng)歸及其他中藥揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用及中藥揮發(fā)油質(zhì)量控制提供了有價(jià)值的資料。

1 材料

1．1 材料與試劑

當(dāng)歸飲片購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系劉春生教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸的干燥根。提取前將當(dāng)歸飲片粉碎成粗粉。

脂多糖，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma-Aldrich公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素—鏈霉素溶液、MTT試劑購自北京索來寶公司;NO試劑盒購自江蘇碧云天生物科技研究所;DMEM培養(yǎng)基、色譜級乙酸乙酯購自Fisher公司。

1．2 儀器與設(shè)備

HA220-50-01超臨界流體萃取儀(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)，BSA224S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，VLK-70分子蒸餾設(shè)備(德國瑞達(dá)有限公司)，Thermo Finnigan 2000 Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜儀器(美國Thermo公司)，Multiskan GO多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 超臨界流體萃取及分子蒸餾

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期已確定的最佳提取工藝對當(dāng)歸進(jìn)行超臨界流體萃取，以CO2為萃取溶劑。提取的工作條件如下:工作壓力:30 MPa，工作溫度:50℃，提取時(shí)間:2小時(shí)，CO2的流量:25 L/h;分離器Ⅰ的工作壓力:8 MPa，溫度:50℃;分離器Ⅱ的壓力為提取系統(tǒng)尾部的壓力，工作溫度:35℃。

用分子蒸餾設(shè)備對所得揮發(fā)油進(jìn)行分餾，工作條件如下:刮刀的轉(zhuǎn)速:300 rpm/min，分子蒸餾過程真空度:0．35 mbar，滴速:每秒1～2滴。本研究中，通過改變溫度來獲得不同的餾分。將所得到的餾分保存在－20℃冰箱中用于進(jìn)一步的研究。

2．2 總提取物與各餾分的GC-MS分析

將各餾分適當(dāng)稀釋后，用無水硫酸鈉脫水，然后用GC-MS進(jìn)行分析，GC-MS條件:柱子型號:安捷倫 DB-5 MS(0．25 mm ×30 m，0．25 μm)，進(jìn)樣口溫度:230℃，升溫程序:80℃以3℃/min升溫至167℃，保持2．5 min;以2℃/min升至202℃，以4℃/min升至280℃，保持15分鐘，載氣為高純氦氣，流速:1 mL/min，進(jìn)樣量:1μL，溶劑延遲:4分鐘。離子源溫度:230℃，電離源:EI，電子能量:70 ev;傳輸線溫度:250℃;四級桿溫度:150℃，掃描質(zhì)量范圍:35～550 amu。

2．3 抗炎能力的測定—餾分對 LPS誘導(dǎo)的RAW264．7釋放NO的抑制作用

2．3．1 RAW264．7 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 小鼠單核巨噬細(xì)胞系細(xì)胞RAW264．7細(xì)胞購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺。細(xì)胞用含有10%胎牛血清，1%青霉素—鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到70% ～80%的時(shí)候進(jìn)行傳代，1～2天換液1次，2～3隔天傳代。

2．3．2 MTT 測定各餾分對 RAW264．7 生長的影響 將處于對數(shù)生長期的 RAW264．7細(xì)胞，按1×104/孔的密度接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)，然后分別加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基，使藥物的最終濃度分別為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12．5 μg/mL、6．25 μg/mL、3.13 μg/mL、1．56 μg/mL，同時(shí)設(shè)置空白對照組與調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，加入5 mg/mL的MTT 20μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，吸出上清液后，每孔加入150μL DMSO，放置于搖床上搖10分鐘，用酶標(biāo)儀測定其在450 nm處的吸光度。

2．3．3 餾分對NO釋放的影響 將處于對數(shù)生長期的RAW264．7細(xì)胞，按照1×104/孔的密度接種于96孔板中，于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)，然后分別加入含藥培養(yǎng)基，使其最終濃度為12．5μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)后，加入 LPS進(jìn)行誘導(dǎo)，LPS的終濃度是10μg/mL，對照組加入等量的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，吸取細(xì)胞上清液進(jìn)行離心，用Griss試劑法測定每組細(xì)胞的上清液中的NO，按照試劑盒上的操作步驟進(jìn)行測定，通過計(jì)算NO抑制率評價(jià)餾分的抗炎作用。

2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3．1 超臨界流體萃取及分子蒸餾

本研究用超臨界流體萃取法制得了棕色澄明的當(dāng)歸揮發(fā)油，得率為1．4%，其中當(dāng)歸揮發(fā)油中主要有效成分藁本內(nèi)酯的相對含量為65．98%。

當(dāng)歸揮發(fā)油進(jìn)行分子蒸餾后得到6個(gè)不同的餾分，在100℃下分離得到了餾分1，然后將殘?jiān)M(jìn)一步分離，在110℃時(shí)，得到餾分2，并將所得的殘?jiān)凑丈鲜龇椒ㄟM(jìn)一步分離，在120℃、130℃、140℃、150℃下分別獲得了餾分3、餾分4、餾分5、餾分6。餾分1到餾分6從淺黃色變化到橙黃色，顏色逐漸加深，黏度增大。

3．2 當(dāng)歸揮發(fā)油分子蒸餾后所得餾分的GC-MS分析

通過與NIST 2．0質(zhì)譜圖庫提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比較，并查閱參考文獻(xiàn)，確定各餾分中的化學(xué)成分。

采用面積歸一化法確定餾分中各化學(xué)成分的相對含量。本研究為研究各餾分中化學(xué)成分與其抗炎作用的相關(guān)性，為簡化分析只對各餾分中相對含量大于1%的化學(xué)成分進(jìn)行分析。GC-MS分析結(jié)果如表1所示。

GC-MS的結(jié)果顯示，藁本內(nèi)酯是各餾分中相對含量最高的成分，各餾分中藁本內(nèi)酯從低到高依次為:餾分6(32．77%)＜餾分5(48．63%)＜餾分 1(62．46%)＜餾分 2(72．27%)＜ 餾分 4(75．28%)＜餾分3(79．97%)。

3．3 抗炎作用

3．3．1 各餾分對 RAW264．7細(xì)胞生長的影響如表2所示，MTT結(jié)果顯示各餾分的藥物濃度在12．5 μg/mL、6．25 μg/mL、3．13 μg/mL、1．56 μg/mL時(shí)對細(xì)胞的正常生長無影響，細(xì)胞生存率與空白對照組相比，無顯著性差異，P ＞0．05。

3．3．2 各餾分的抗炎作用 本研究考察了各餾分藥物濃度在 12．5 μg/mL、6．25 μg/mL、3．13 μg/mL、1.56μg/mL時(shí)對LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞 NO釋放的影響，結(jié)果顯示當(dāng)藥物濃度分別為6．25 μg/mL、3．13 μg/mL、1．56 μg/mL 能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞NO的釋放，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。因此本研究選用各餾分濃度為12．5 μg/mL(P ＜0．05)時(shí)對 LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞釋放NO的影響作為抗炎作用評價(jià)指標(biāo)。結(jié)果如表3所示。

抗炎結(jié)果顯示在所得的6個(gè)餾分中餾分4的抗炎能力最強(qiáng)，而餾分1和餾分5的能力相對較弱。如表2所示，各餾分的抗炎能力與餾分中藁本內(nèi)酯的含量不成劑量依賴，餾分中其他成分對餾分抗炎作用的貢獻(xiàn)是值得關(guān)注的。

3．4 偏最小二乘法回歸分析

為了研究餾分中化學(xué)成分(相對含量＞1%)與其抗炎作用的相關(guān)性，本研究采用SIMCA-P 11．5偏最小二乘法回歸分析，分析餾分中化學(xué)成分與抗炎作用的相關(guān)性。將各餾分中含量＞1%的化學(xué)成分的相對含量作為自變量，其抑制NO釋放的百分比作為因變量進(jìn)行回歸分析。

PLSR分析結(jié)果顯示餾分中的化學(xué)成分十九烷:2，2-二甲基-1-苯基-1-丙醇、Z-藁本內(nèi)酯、E-藁本內(nèi)酯、十六烷、阿魏酸、十三酸、亞油酸、油酸、5，8，11-十七碳三炔酸甲酯與餾分抗炎作用呈正相關(guān);(－ )-檸檬烯、6-丁基-1，4-環(huán)庚二烯、β-柏木烯、順-11，14，17-二十碳三烯酸甲酯、1-石竹烯、紅沒藥醇、桉油烯醇、1-(2，4-二甲基苯基)-1-丙酮、丁烯基苯酞、十五烷、2，6，10，14-四甲基十五烷、2，6，11-三甲基十二烷、十八烷、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸、3-羥基甲基烯-2-樟腦、(Z)-氧代環(huán)十七碳-8-烯-2-酮、Ethyl 9，9-diformylnona-2，4，6，8-tetraenoate、己二酸-1-(2-乙基己基)酯與餾分的抗炎藥效呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果如表4所示。

在偏最小二乘法中，自變量在解釋因變量重要程度的大小時(shí)可以用投影變量重要性指標(biāo)值來評價(jià)，其值越大說明自變量對因變量解釋的重要程度越大。

餾分中，各化學(xué)成分的變量重要性值如表5所示，當(dāng)變量重要性值大于1時(shí)說明自變量能對因變量做一個(gè)更好的解釋，各化學(xué)成分中變量重要性值大于1的化學(xué)成分有十三酸、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、β-柏木烯、順-11，14，17-二十碳三烯酸甲酯、紅沒藥醇、桉油烯醇、1-石竹烯、十九烷、亞油酸、十五烷、2，6，11-三甲基十二烷、十八烷、E-藁本內(nèi)酯、阿魏酸、油酸。結(jié)果如表5所示。

表1 各餾分GC-MS的分析結(jié)果(只顯示相對含量大于1%的化學(xué)成分)

表2 不同濃度的各餾分對細(xì)胞生存率的影響(x±s)

表3 各餾分中藁本內(nèi)酯的相對含量及其抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞釋放NO的抑制率(±s)

表3 各餾分中藁本內(nèi)酯的相對含量及其抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞釋放NO的抑制率(±s)

餾分 藁本內(nèi)酯相對含量(%) NO抑制率(%)62．46 11．89 ±2．43餾分2 72．27 27．58 ±9．25餾分3 79．97 32．25 ±4．76餾分4 75．28 50．27 ±3．42餾分5 48．63 13．91 ±6．75餾分6餾分1 32．77 44．76 ±13．46

表4 各餾分化學(xué)成分與抗炎作用的PLSR的回歸系數(shù)

表5 各餾分化學(xué)成分影響抗炎作用的變量重要性值(＞1)

偏最小二乘法的一個(gè)重要用途是用于預(yù)測建模，以各樣本點(diǎn)在Y的原始數(shù)據(jù)為觀測值，以回歸方程的擬合值y＇為預(yù)測值，繪制觀測值和預(yù)測值的散點(diǎn)圖，如下圖所示，所有的樣本點(diǎn)均排列在途中對角線附近，有關(guān)化學(xué)成分與藥效之間的預(yù)測模型的擬合結(jié)果:y=1*x+2．935e－0．07，R2=0．997，其預(yù)測結(jié)果是令人滿意的，結(jié)果如圖1所示。

圖1 各餾分化學(xué)成分影響抗炎作用PLSR回歸模型

4 討論

超臨界流體萃取法是一種快速、清潔的提取技術(shù)，是中藥揮發(fā)油常用的提取手段之一。分子蒸餾，也稱為短程蒸餾，是一種快速、高效、無污染的分離和濃縮技術(shù)，是分離和純化的天然產(chǎn)物的常用的方法，特別適用于高沸點(diǎn)、高黏度且熱敏性物質(zhì)分離，被廣泛地用于中草藥揮發(fā)油和其它精油的分離［4-6］。

偏最小二乘法是結(jié)合了主成分提取和相關(guān)性分析的綜合建模方法，被稱為第二代回歸技術(shù)，通過成分提取，以主成分分析過程通過協(xié)方差矩陣篩選出變異信息貢獻(xiàn)程度最大的綜合性成分，再通過這些選出來的綜合成分建立回歸模型［7］。

本研究用分子蒸餾的方法對當(dāng)歸揮發(fā)油蒸餾后得到了6個(gè)餾分，GC-MS分析結(jié)果顯示藁本內(nèi)酯仍是各餾分的主要成分但有較大差異，抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同餾分的抗炎作用不同(P＜0．05)，且與餾分中藁本內(nèi)酯的含量沒有依賴性，PLSR結(jié)果抗炎藥效與化學(xué)成分存在較好的線性，說明模型建立是合理的，PLSR結(jié)果顯示除藁本內(nèi)酯外，當(dāng)歸超臨界提取物中與藁本內(nèi)酯的共存成分對其抗炎活性也起到了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)為當(dāng)歸及其他中草藥揮發(fā)油的進(jìn)一步研究開發(fā)和利用提供了有價(jià)值的資料。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，通過多途徑多靶點(diǎn)發(fā)揮藥效，若僅通過某一成分或某幾個(gè)成分對其進(jìn)行質(zhì)量控制不能代表中藥的整體性，通過建立藥效與化學(xué)成分的相關(guān)模型進(jìn)行質(zhì)量控制是必要的。中藥揮發(fā)油的藥理作用廣泛，有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用。而中藥揮發(fā)油成分復(fù)雜，中藥揮發(fā)油的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)廣泛［8］，因此有目的的針對揮發(fā)油中的多種藥效成分進(jìn)行質(zhì)量控制是保證中藥揮發(fā)油質(zhì)量和藥效穩(wěn)定的一個(gè)有效手段，本研究為當(dāng)歸及其他中藥揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用和質(zhì)量控制進(jìn)行了有益的探索并為其提供了數(shù)據(jù)支持。

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