朱小香 鄭淑霞 薩喆燕 修春英 董亞琴 許金森

既往研究表明［1-3］，針刺足三里穴對胃黏膜損傷具有防治作用，然而其具體作用機(jī)制仍不清楚。上世紀(jì)70年代以來發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的能量分子ATP也是一種神經(jīng)遞質(zhì)，其參與了從中樞到外周諸多組織細(xì)胞的生理生化機(jī)能。現(xiàn)代生物學(xué)對ATP及其受體P2X的研究成果為揭示針刺信號的轉(zhuǎn)換機(jī)制提供了充實(shí)的理論依據(jù)。目前研究發(fā)現(xiàn)P2X有P2X1-77個(gè)亞型，其中P2X1被認(rèn)為與膀胱機(jī)能調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4］。越來越多的研究證明P2X受體在胃腸道平滑肌的收縮和舒張中發(fā)揮著重要作用［5］，但具體亞型在其中所扮演的角色尚未完全清楚。胃和膀胱的共同特點(diǎn)之一是平滑肌都是其運(yùn)動單元的一個(gè)重要組成部分，那么P2X1等亞型是否也在胃功能調(diào)節(jié)中起重要作用?另外，電針足三里穴治療胃黏膜損傷的作用機(jī)制是否與P2X受體亞型相關(guān)?為此，本文運(yùn)用分子生物學(xué)方法從基因轉(zhuǎn)錄水平研究正常大鼠和胃黏膜應(yīng)激損傷大鼠胃組織 P2X1、P2X3、P2X5亞型的表達(dá)情況以及電針足三里穴對其的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

成年SD雄性健康大鼠24只(福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，清潔級，許可證號:SCXK(閩)2012-0001。體重(250±25)g。動物稱重編號，隨機(jī)分為3組:正常對照組(正常組)、胃黏膜應(yīng)激損傷模型組(模型組)、電針足三里穴組(電針組)各8只。

1.2 胃黏膜應(yīng)激損傷模型制備

胃黏膜應(yīng)激損傷大鼠模型制備采用冷-束縛應(yīng)激法［6］并加以改良。造模方法:大鼠禁食不禁水24小時(shí)，束縛四肢于自制鐵板上，放入7℃冰箱，冷應(yīng)激2.5小時(shí)后取出松綁。模型成功的標(biāo)準(zhǔn):大鼠安靜，萎靡不振，身體蜷縮;形態(tài)學(xué)上動物胃黏膜有出血點(diǎn)和潰瘍灶。除正常組外，其余兩組大鼠均按冷-束縛應(yīng)激法復(fù)制胃黏膜應(yīng)激損傷模型。

1.3 干預(yù)方法

模型復(fù)制后，次日電針組給予電針治療:一次性無菌針灸針(0.18×13mm)直刺足三里穴1 cm(參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠針灸穴位圖譜定位［7］)，參考電極置于胃經(jīng)線上足三里穴下0.5 cm處，疏密波，10/20Hz，刺激強(qiáng)度2～3 V，以下肢出現(xiàn)輕微抖動為度，電針20分鐘，連續(xù)三天。模型組和正常組均不進(jìn)行電針干預(yù)。

1.4 主要試劑

總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為Promega生物公司產(chǎn)品;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品;引物由Invitrogen生物公司合成;GeneFinder染料為致善生物公司產(chǎn)品;DNA Marker為Bio Flux公司產(chǎn)品。

1.5 主要儀器

DU530核酸/蛋白分析儀(Beckman Coulter公司);Veriti PCR儀(ABI公司);Gene Genious生物成像系統(tǒng)(SYNGENE公司);WQ-IOD1電針儀(北京欣東華電子儀器有限公司)。

1.6 P2X亞型mRNA檢測

電針組治療結(jié)束后24小時(shí)以1%烏拉坦麻醉各組大鼠，剖腹取胃，沿胃大彎剪開、展平并用冰生理鹽水清洗胃內(nèi)容物，全胃剪碎后置于預(yù)裝有100 μL總RNA提取裂解液的EP管中，液氮研磨后按Promega公司Z3100總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。然后核酸蛋白分析儀檢測RNA純度及濃度;取1μg總RNA，使用Promega公司A3500反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);取3μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行P2X亞型的PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置β-actin作內(nèi)參照。大鼠P2X1上游引物5'-AAAGCAGAAAGGAAAGCCCA-3'，下游引物為 5’-ATACAGTCCGTGGAACTGG-3’，擴(kuò)增片段長度為435 bp;P2X3上游引物5'-CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3'，下 游 引 物 為 5'-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3'，擴(kuò)增片段長度為520 bp;P2X5上游引物5'-AGTCATCAACATTGGTTCTG-3'，下 游 引 物 為 5'-CAGGAGACCTTCCGTGAAA-3'，擴(kuò)增片段長度為542 bp;β-actin上游引物為 5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，下游引物為 5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，擴(kuò)增片段長度為240bp。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3分鐘→(94℃變性40秒，退火1分鐘，72℃延伸1分鐘)，共循環(huán)35次→72℃延伸10分鐘;退為溫度如下:P2X1為53℃，P2X3和P2X5前6個(gè)循環(huán)為53℃，后29個(gè)循環(huán)為48.5℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，使用生物成像系統(tǒng)對電泳條帶進(jìn)行圖像采集和光密度值分析，目的基因與內(nèi)參β-actin電泳條帶的光密度比值即為目的基因mRNA在組織中的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

各組大鼠胃組織均表達(dá)P2X1、P2X3、P2X5mRNA。經(jīng)單因素方差分析LSD檢驗(yàn)，模型組與正常組相比，大鼠胃組織P2X1mRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.01);而電針組與模型組相比，大鼠胃組織P2X1mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。P2X3、P2X5mRNA組間未見顯著差異。對正常組大鼠胃組織P2X1、P2X3、P2X5受體亞型作相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)正常組大鼠胃組織P2X3和P2X5呈顯著正相關(guān)(P＜0.05，r(3，5)=0.755)。見表 1。

表1 各組大鼠胃組織P2X亞型mRNA的比較(，n=8)

表1 各組大鼠胃組織P2X亞型mRNA的比較(，n=8)

注:與正常組比較，a P＜0.01;與模型組比較，b P＜0.05。正常組3個(gè)亞型作相關(guān)性分析，P2X3與 P2X5顯著正相關(guān)，c P＜0.05，r(3，5)=0.755

-actin正常組 0.1789±0.0342 0.2473±0.0609c組別 P2X1/β-actin P2X3/β-actin P2X5/β 0.4485±0.0743 0.7851±0.0739 0.6653±0.0669模型組 0.0543±0.0274a 0.3293±0.1298 0.6853±0.1102電針組 0.1498±0.0162b

3 討論

P2X受體是ATP門控的離子通道，當(dāng)它與胞外ATP結(jié)合時(shí)，P2X通道打開，允許Ca2+、單價(jià)陽離子以及小的有機(jī)離子通過［8］，繼而引起一系列生理或病理變化。P2X受體廣泛表達(dá)于從變形蟲到人類的一系列生物體中［9］。目前已克隆出7個(gè)P2X亞型，分別為 P2X1，P2X2，…P2X7［10］。這些亞單位能夠以同聚體或異聚體的形式形成功能性通道［11-12］。許多細(xì)胞同時(shí)表達(dá)不同類型的P2X亞單位，也暗示天然的P2X受體通常以異聚體的形式存在。本研究團(tuán)隊(duì)對正常組3個(gè)亞型間的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，P2X3與P2X5呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，提示在大鼠胃組織中P2X3和P2X5二者之間可能在mRNA轉(zhuǎn)錄水平存在共表達(dá)，它們可能以同聚體的方式存在，也可能以異聚體的形式存在。

P2X1亞型在調(diào)節(jié)膀胱功能方面具有重要作用［4］。OREILLY 等［13］于2001 年用定量 RT-PCR 比較胎兒和成年人的膀胱表達(dá)7個(gè)已知P2X受體的情況，發(fā)現(xiàn)正常成人膀胱P2X1在信使RNA水平是主要嘌呤受體。之后，李永剛等［4］研究發(fā)現(xiàn)P2X1受體在膀胱出口部分梗阻大鼠膀胱組織中表達(dá)升高，推測其可能參與慢性膀胱出口梗阻后膀胱的生理或病理功能的調(diào)節(jié)。楊昕等［14］認(rèn)為P2X1受體可能在介導(dǎo)嘌呤能神經(jīng)對逼尿肌功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究證明P2X受體在胃腸道平滑肌的收縮和舒張中也發(fā)揮著重要作用［5］。本研究發(fā)現(xiàn)胃黏膜應(yīng)激損傷模型組與正常組相比，大鼠胃組織P2X1mRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.01)，提示P2X1亞型在胃功能的生理和病理調(diào)節(jié)中具有重要作用。胃和膀胱的共同特點(diǎn)之一是平滑肌都是其運(yùn)動單元的一個(gè)重要組成部分，結(jié)合前人研究結(jié)果，筆者推測P2X1可能在平滑肌功能調(diào)節(jié)中具有重要的作用。

隨著人們對ATP及其受體P2X功能特點(diǎn)認(rèn)識的不斷深入，有學(xué)者推測它們在針刺信號轉(zhuǎn)換機(jī)制中可能具有重要的作用［15］。針刺作為一種機(jī)械性刺激為主的復(fù)雜刺激源，只有轉(zhuǎn)化為生物信號才能被機(jī)體所識別。ATP所具備的信號分子特征，以及P2X受體的組織分布特點(diǎn)，強(qiáng)烈暗示ATP-P2X在針刺信號轉(zhuǎn)換中具有重要作用［15］。因此，本研究團(tuán)隊(duì)以臨床上療效較為明確的“針刺足三里調(diào)節(jié)胃功能”為研究主題，以 P2X1、P2X3、P2X5作為觀察指標(biāo)，在針刺信號轉(zhuǎn)換機(jī)制研究方面作一嘗試。本研究發(fā)現(xiàn)電針組大鼠胃組織P2X1mRNA顯著高于模型組(P＜0.05)，提示電針足三里穴對胃黏膜應(yīng)激損傷的調(diào)節(jié)機(jī)制之一可能與P2X1mRNA表達(dá)上調(diào)相關(guān)。P2X受體是ATP門控的離子通道，其功能的發(fā)揮需要ATP的激活。有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的ATP能在短時(shí)期內(nèi)刺激P2X1受體高表達(dá)［16］。電針足三里刺激穴位可能通過經(jīng)穴與臟腑的特異聯(lián)系以及神經(jīng)-內(nèi)分泌等途徑使支配胃平滑肌的副交感神經(jīng)末梢釋放ATP增加以及胃組織表達(dá)P2X1等升高，在這些因素的協(xié)同作用下通過改善胃黏膜血流供應(yīng)、胃組織能量供應(yīng)等途徑促進(jìn)胃潰瘍的愈合。此外，P2X1受體是血小板三種P2受體中的一種，其被ATP激活后可介導(dǎo)血小板聚集，有利于正常止血［17］，在潰瘍病灶的發(fā)生發(fā)展中，這將有利于防止?jié)冊畹倪M(jìn)一步出血。當(dāng)然，這只是根據(jù)研究結(jié)果所做的推測，具體機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。今后也有必要對針刺局部組織和胃組織中的ATP和其他P2X受體亞型進(jìn)行檢測，以更明確各個(gè)P2X受體亞型在針刺效應(yīng)中的作用。

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