李艷芝 姜靜靜

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 日照276826）

枸骨（Ilex cornuta Lindl．et Paxt．）為冬青科冬青屬植物［1］，其葉、果實(shí)和根均可藥用，傳統(tǒng)入藥部位為葉，為苦丁茶來源之一［2］，是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化及減肥的良好飲品［3］。黃酮類化合物為枸骨中主要有效成分［4－5］，測定其含量可作為評(píng)價(jià)枸骨質(zhì)量的依據(jù)。本文采用反相高效液相色譜法測定了枸骨不同部位及不同采收期枸骨葉中蘆丁和槲皮素含量，為枸骨的質(zhì)量控制及合理采收提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1．1 儀器

島津LC－20A高效液相色譜儀；LC－20AT泵；SIL－20A 自 動(dòng) 進(jìn) 樣 器；SPD－M20A 檢 測 器；CTo－20AC柱恒溫箱控制器；LC Solution工作站；SYZ－550石英亞沸高純水蒸餾器（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)）；LD－02型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)﹙中國溫嶺市大海藥材器械廠﹚。

1．2 試劑與藥品

枸骨樣品采自山東日照，經(jīng)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室鑒定為冬青科冬青屬植物枸骨，自然陰干，備用；蘆丁對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號(hào)100080－200707）；槲皮素對(duì)照品（南昌貝塔生物科技有限公司，供含量測定用，批號(hào)10199－081219）；甲醇為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑為分析純。

2 含量測定

2．1 色譜條件

C18柱（250mm×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇－0．5%磷酸水溶液（47：53）；柱溫：25℃；流速：0．7ml／min；檢測波長：356nm；理論塔板數(shù)按蘆丁和槲皮素計(jì)算均大于4000。外標(biāo)法定量分析。對(duì)照品和樣品色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品及枸骨樣品高效液相色譜圖

2．2 對(duì)照品溶液的制備

用甲醇分別溶解干燥至恒重的蘆丁和槲皮素對(duì)照品適量，配制成蘆丁0．26mg／ml和槲皮素0．17mg／ml的混合對(duì)照品溶液。

2．3 線性關(guān)系考察

參照文獻(xiàn)［6－7］進(jìn)行線性關(guān)系考察，得蘆丁和槲皮素的回歸方程分別為Y＝15587X＋20055（r＝0．9999），Y＝40012X－48581（r＝0．9999），蘆丁和槲皮素的線性范圍分別為0．52～5．2μg和0．34～3．4μg。

2．4 樣品溶液的制備

分別精密稱取5．0g枸骨嫩葉、老葉、枝、青果、紅果及不同采收期枸骨葉粉末（過40目篩），加適量90%乙醇超聲提取2次，每次30min，合并2次濾液濃縮得浸膏，用甲醇定容至25ml容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜（0．45μm）濾過，取續(xù)濾液為樣品溶液。

2．5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果蘆丁和槲皮素的峰面積RSD分別為0．78%和0．91%。

2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好，峰面積的RSD為0．81% （n＝6）。

2．7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取枸骨老葉樣品6份（每份5．0g），按樣品溶液制備方法制備6份樣品溶液，各進(jìn)樣20μL測定。結(jié)果RSD為1．73%，表明方法重復(fù)性良好。

2．8 加樣回收率試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行回收率試驗(yàn)，計(jì)算蘆丁和槲皮素平均回收率（n＝6）分別為98．6%和99．2%，RSD分別為1．70%和1．91%。

2．9 樣品測定

按樣品溶液制備方法制備各樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20μL，得各樣品蘆丁和槲皮素含量，結(jié)果見表1和表2。

表2 不同采收期枸骨葉中蘆丁和槲皮素含量測定結(jié)果（n＝3）

3 討論

3．1 提取條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了加熱回流和超聲提取2種方法，結(jié)果表明超聲提取率高，雜質(zhì)少，故選取超聲提取法；提取溶劑的選擇我們比較了甲醇和不同濃度乙醇的提取效率，結(jié)果表明用90%乙醇提取效果最好；同時(shí)比較了超聲提取時(shí)間及提取次數(shù)的提取率，結(jié)果表明超聲提取2次，每次30min提取率最高，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定樣品提取方法為采用90%乙醇為提取溶劑，超聲提取2次，每次30 min。

3．2 測定波長的選擇

對(duì)混合對(duì)照品和樣品溶液在200～600nm進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明，兩者均在356nm波長處有最大吸收，且干擾比較小，故選擇356nm作為檢測波長。

3．3 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)對(duì)甲醇－冰醋酸水溶液系統(tǒng)、甲醇－水系統(tǒng)、甲醇－0．5%磷酸水溶液系統(tǒng)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，甲醇－0．5%磷酸水溶液系統(tǒng)（47∶53）分離度好、峰形較好，滿足分離要求。

3．4 小結(jié)

本文采用反相高效液相色譜法測定了枸骨不同部位：嫩葉、老葉、枝、青果、紅果及不同采收期枸骨葉中蘆丁和槲皮素含量，測定結(jié)果表明，枸骨中蘆丁和槲皮素含量與藥用部位有關(guān)，葉中的含量明顯高于其他部位，與傳統(tǒng)入藥部位為葉相吻合，不同部位的蘆丁和槲皮素含量順序均為：葉＞枝＞果實(shí)，且同一部位中蘆丁含量均高于槲皮素；不同采收期枸骨葉中黃酮類化合物含量有顯著差異，其中3月份含量最高。另外，2010年版中國藥典一部收錄的枸骨葉，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)沒有含量測定項(xiàng)，本文為枸骨葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］ 國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典一部［S］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：233．

［2］ 邱豐艷，王小精．冬青屬苦丁茶的藥理研究進(jìn)展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（32）：10350－10352．

［3］ 李維林，吳菊蘭，任冰如，等．枸骨的化學(xué)成分［J］．植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2003，12（2）：1－5．

［4］ 左文健，梅文莉，曾艷波，等．枸骨的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（27）：16560－16562．

［5］ 洪艷平，上官新晨，劉楠，等．枸骨葉總黃酮提取與測定［J］．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（3）：529－533．

［6］ 崔濤，夏偉軍，彭玲芳．七葉蓮提取物中總黃酮和槲皮素的含量測定［J］．藥物分析雜志，2011，31（11）：2054－2057．

［7］ 茅向軍，許乾麗，鮑家科，等．HPLC法測定一枝黃花中蘆丁的含量［J］．藥物分析雜志，2010，30（9）：1785－1787．

［8］ 徐力．HPLC法測定飛燕草中蘆丁的含量［J］．中國當(dāng)代醫(yī)藥，2011，18（33）：49－50．

［9］ 王金梅，高健，郅妙利，等．HPLC法測定連翹中葉、莖、果實(shí)等不同部位蘆丁的含量［J］．河南大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（4）：23－25．