孫金豪梁坤倫王海鶴

（1.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第一附屬中學(xué)，河南 鄭州 450000）

信陽(yáng)水牛促生長(zhǎng)激素釋放激素基因第4外顯子的PCR擴(kuò)增及變異檢測(cè)

孫金豪1梁坤倫1王海鶴2

（1.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第一附屬中學(xué)，河南 鄭州 450000）

本研究以52頭中國(guó)信陽(yáng)水牛血樣為材料，提取基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（PCR-SSCP），對(duì)信陽(yáng)水牛的生長(zhǎng)素釋放激素（GHRH）基因中第4外顯子的突變情況進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)SSCP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同個(gè)體的PCR反應(yīng)產(chǎn)物銀染后有兩種不同的帶型，分別命名為AA型和AB型。針對(duì)不同帶型所對(duì)應(yīng)的個(gè)體PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，在該基因（GI:194719389）的第4外顯子70bp處發(fā)現(xiàn)A→G突變，A→G導(dǎo)致Thr轉(zhuǎn)化為Ala，在該基因的第4內(nèi)含子6bp處發(fā)現(xiàn)A→C突變。

信陽(yáng)水牛；GHRH基因；SNP；DNA提??；PCR-SSCP

信陽(yáng)水牛為我國(guó)河南省的沼澤型水牛。曾經(jīng)，信陽(yáng)水牛是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要?jiǎng)恿Γ婢呷庥脙r(jià)值。隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化的普及，信陽(yáng)水牛的數(shù)量驟然下降。

國(guó)際水牛聯(lián)合會(huì)于第六屆世界水牛聯(lián)合會(huì)議中指出新世紀(jì)水牛的發(fā)展應(yīng)秉持“奶用為主，肉用為輔”的原則，會(huì)議認(rèn)為水奶牛業(yè)將會(huì)成為一項(xiàng)新產(chǎn)業(yè)［1］。對(duì)家畜在常規(guī)育種的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行分子水平的選育，可以加速遺傳進(jìn)展。通過(guò)用分子育種的方法，篩選與信陽(yáng)水牛產(chǎn)奶產(chǎn)肉性狀密切相關(guān)的基因，挖掘其影響信陽(yáng)水牛乳肉性能的分子生物學(xué)機(jī)制是當(dāng)前信陽(yáng)水牛育種亟須解決的問(wèn)題。

正常情況下，生長(zhǎng)激素釋放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）是在已知的促進(jìn)生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）的分泌過(guò)程中最為重要的一種激素。GHRH作為GH的正調(diào)控因子，促進(jìn)GH的合成和分泌，通過(guò)GH間接的影響動(dòng)物的生長(zhǎng)速度和乳腺蛋白質(zhì)的合成［2］。有研究表明，GHRH基因位于牛的13號(hào)染色體上，其全基因序列長(zhǎng)度為9356bp，并且該基因有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。Hodate等報(bào)道，給奶牛注射GHRH14天后，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)組產(chǎn)奶量高11%~19%。給牛注射GHRH類似物，可提高血清中GH和IGF-I的濃度，連續(xù)注射24天，產(chǎn)奶量增加30%。Hyun Sub Cheng等人在對(duì)朝鮮肉牛的基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)了其GHRH基因5'端區(qū)存在一個(gè)單核苷酸的多態(tài)性（SNP），該SNP對(duì)朝鮮肉牛的產(chǎn)肉性能及肉質(zhì)性狀造成了一定的影響。但是在對(duì)信陽(yáng)水牛進(jìn)行研究的過(guò)程中，并沒(méi)有形成關(guān)于GHRH基因影響水牛產(chǎn)肉性能的相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用PCR-SSCP結(jié)合測(cè)序技術(shù)，對(duì)信陽(yáng)水牛GHRH基因的第4外顯子的突變情況以及其產(chǎn)肉的性能、性狀存在的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行檢測(cè)分析，以推動(dòng)信陽(yáng)水牛乳肉產(chǎn)業(yè)的科學(xué)快速發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集來(lái)自信陽(yáng)光山牛場(chǎng)的52頭信陽(yáng)水牛血液樣本，采血方式為靜脈采血，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，所使用的血液樣本均不存在親緣關(guān)系。以-20℃的溫度保存檸檬酸鈉抗凝（ACD）方便備用。

1.1.2 主要試劑 Platinum Tap DNA聚合酶，貨號(hào)C10966-018，選購(gòu)自杭州沃森生物技術(shù)有限公司；2× Reaction Mix，選購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR Marker DL2000，北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Tris飽和酚、蛋白酶K、丙烯酰胺、二甲基甲酰胺等其他試劑均選購(gòu)自上海欣百諾生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)：TL988-Ⅰ型，48孔）；電泳儀（型號(hào)：6C）；水平電泳槽（型號(hào)：JY-SPBT）；垂直板電泳槽（型號(hào)：DYC-350L）；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)ZF-258型）；高速離心機(jī)（型號(hào)：Mini Spin）；移液槍（型號(hào)：Finnpipette）。

1.2 方法

1.2.1 常用試劑及緩沖液的配制 所有溶液和緩沖液均采用蒸餾水配置并高壓滅菌。①8%聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠（兩板膠）：40%丙烯酰胺貯液10mL，10× TBE 10mL，10%過(guò)硫酸胺500μL，TEMED 50μL，加雙蒸水至50mL，輕輕搖晃使其混勻；②顯色液（2%NaOH）：取無(wú)水NaOH 10g，加入到500mL蒸餾水中，使其溶解，用時(shí)加入37%甲醛1mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；其他試劑和溶液的配制均參照相關(guān)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。

1.2.2 全血基因組DNA提取 用酚氯仿抽提法，從冷凍血樣中提取基因組DNA，溶于TE中，4℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)牛GHRH基因DNA序列，引用Primer5.0生物軟件設(shè)計(jì)引物表（引物序列由河南中大生物工程有限公司合成）

1.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增總體積為15μL，其中2× Reaction Mix為7.5μL、Platinum Tap DNA聚合酶為0.15 μL、上游引物GHRH 4S為0.2μL、下游引物GHRH 4A為0.2μL、無(wú)菌水為5.95μL、DNA模板為1μL。

1.2.5 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè) 將5μLPCR產(chǎn)物與1μL緩沖液均勻混合，點(diǎn)樣于濃度為1.5%瓊脂糖（0.21g瓊脂糖，14mL 0.5×TBE緩沖液）在膠孔中進(jìn)行凝固，電壓= 50V，電泳=50min，進(jìn)行溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察結(jié)果，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照，保存結(jié)果。

1.2.6 聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳 SSCP具體操作步驟參照相關(guān)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。

1.2.7 分析圖像 用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行照相分析。用EB對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行染色，用紫外線照相。用AgNO3/NaOH對(duì)聚丙烯酰胺進(jìn)行染色和顯色，用白光照相。

1.2.8 DNA序列測(cè)定 經(jīng)SSCP分析后，將不同基因型個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和對(duì)應(yīng)的上、下游引物送交至河南中大生物工程有限公司進(jìn)行后續(xù)工作。

2 結(jié)果

2.1 信陽(yáng)水牛GHRH基因第4外顯子區(qū)的PCR凝膠電泳檢測(cè)

信陽(yáng)水牛GHRH基因第4外顯子區(qū)的PCR凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，見圖1。

所合成的引物擴(kuò)增基因組，用濃度為1.5%的瓊脂糖對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將擴(kuò)增片段擴(kuò)增至331bp，保持條帶清晰且特異性良好，無(wú)引物帶和雜帶可直接用于SSCP分析。

2.3 信陽(yáng)水牛GHRH基因的第4外顯子區(qū)PAGE凝膠電泳檢測(cè)

信陽(yáng)水牛GHRH基因的第4外顯子區(qū)PAGE凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，見圖2。

根據(jù)電泳圖發(fā)現(xiàn)了2種基因型，一種為純合子（AA型），一種為雜合子（AB型），并未發(fā)現(xiàn)BB型。

2.3 信陽(yáng)水牛GHRH基因的第4外顯子區(qū)PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果

信陽(yáng)水牛GHRH基因的第4外顯子區(qū)PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果（見圖3、4），由圖3、4可知，AB型在GHRH基因的7066位點(diǎn)（第4外顯子區(qū)）發(fā)現(xiàn)A→G突變，導(dǎo)致Thr轉(zhuǎn)化為Ala（見圖5）；在該基因的7122位點(diǎn)（第4內(nèi)含子區(qū)）發(fā)現(xiàn)A→C突變。

3 討論與結(jié)論

生長(zhǎng)激素釋放激素（GHRH）是經(jīng)由下丘腦分泌得到的一種多肽物質(zhì)，它是一種生長(zhǎng)激素正性調(diào)控因子，具有促進(jìn)垂體合成以及分泌生長(zhǎng)激素的作用。研究表明，注射GHRH可顯著改善動(dòng)物生長(zhǎng)速度和肉質(zhì)情況。

有研究表明，直接測(cè)序法在Hanwoo牛的GHRH基因中發(fā)現(xiàn)了12個(gè)SNP，并發(fā)現(xiàn)了-4241>T、CW（cold carcass weight）和EMA（longissimus muscle area）有明顯的關(guān)聯(lián)性，-4241>T的遺傳效應(yīng)為基因劑量依賴。Moody等人的研究結(jié)果表明，牛GHRH基因的外顯子3存在一個(gè)GHRH-HaeⅢ多態(tài)位點(diǎn)。而且，赫福特牛和安格斯牛的A等位基因頻率分別為0.07和0.70。但在本次研究中，僅在信陽(yáng)水牛群體中發(fā)現(xiàn)了AA、AB兩種類型的個(gè)體。

通過(guò)對(duì)荷斯坦牛進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AA個(gè)體的乳脂產(chǎn)量較高；而Girolando奶牛的AB型個(gè)體泌乳期則明顯高于BB型個(gè)體。Curi等人進(jìn)行的肉牛GHRH外顯子3HaeⅢ多態(tài)與生長(zhǎng)和屠宰性狀相關(guān)性分析中，未發(fā)現(xiàn)其存在明顯相關(guān)性?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明GHRH基因是在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和泌乳過(guò)程中一項(xiàng)重要的候選基因。在本研究中，發(fā)現(xiàn)信陽(yáng)水牛GHRH外顯子4和內(nèi)含子4內(nèi)存在部分突變，通過(guò)性狀關(guān)聯(lián)分析將發(fā)現(xiàn)該突變是否影響信陽(yáng)水牛的乳肉性能。本研究的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只包含部分內(nèi)含子，有可能在未擴(kuò)增到的內(nèi)含子里仍然存在部分突變位點(diǎn)，這些突變有可能也影響信陽(yáng)水牛的乳肉性能，有待進(jìn)一步研究。

［1］王雷，丁春華，欒爽艷.我國(guó)水牛奶業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與開發(fā)前景［J］.中國(guó)奶牛，2008（4）：8-10.

［2］李芳芳.廣西巴馬小型豬促生長(zhǎng)激素釋放激素成熟肽基因克隆及其真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)小鼠生長(zhǎng)效應(yīng)的研究［D］.廣西大學(xué)，2007.

PCR Am plification and M utation Detection of GHRH Gene Based on 4th Exon Sequences for Xinyang Buffalo

Sun Jinhao1Liang Kunlun1Wang Haihe2
（1.Huanghe Scienceand Technology College,Zhengzhou Henan 4500003;2.No.1Middle School Affiliated to Zhengzhou University,Zhengzhou Henan 450000）

This study was aimed to detect SNPs of GHRH gene on 4th Exon Sequences gene in 52 blood samples from Xinyang buffalo,using themethod of PCR-SSCP to extract DNA.The results from PCR-SSCP showed that there were two different band type in different after PCR reaction products silver staining of different individuals,named as AA and AB types respectively.The results from sequencing showed that A→G mutation which caused Thr trans?ferred to Ala at70 in exon4 of the gene（GI:194719389）and A→Cmutation at6 in intron4 were detected.

Xinyang buffalo;GHRH gene;SNP;DNA extraction;PCR-SSCP

S823

A

1003-5168（2015）06-0114-3

2015-5-20

孫金豪（1986.4-），男，本科，助教，研究方向：生物化學(xué)。