周松林等

[摘要] 目的 給脂溶性的抗腫瘤藥物篩選高溶解性、低細(xì)胞毒性的有機溶劑。 方法 采用MTT法，按照不同純度，對8種能溶于水的有機溶劑，測試其對黑色素瘤B16、人胃癌細(xì)胞SGC-7901兩種細(xì)胞株的細(xì)胞毒性。 結(jié)果 不同有機溶劑對不同細(xì)胞株的抑制皆不同，甲醇與丙酮對兩種細(xì)胞株的毒性相對都較弱，純度越高的有機溶劑對細(xì)胞毒害越小。 結(jié)論 光譜純的甲醇與丙酮是脂溶性抗腫瘤藥物有效的有機溶劑。

[關(guān)鍵詞] MTT；細(xì)胞毒性；有機溶劑；純度

[中圖分類號] R915 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）02（b）-0144-03

Inhibitory effect of different purity organic solvents on two tumor cells

ZHOU Song-lin LIN Ying-ying ZHAO Huan-ge HUANG Yong-hao

Key Laboratory of Tropical Medicine，Hainan Medical College，Haikou 571199，China

[Abstract] Objective To select organic solvents with low cytotoxicity for dissolve some compounds which had bad water-solubility in screening antitumor agent compound. Methods The cytotoxic effect of 8 organic solvents both can dissolve in water and fat soluble organic solvents with different purity on two tumor cell lines（B16 and SGC-7901）were tested by MTT. Results Different organic solvents inhibit different cell lines were different，the effect of methanol and acetone toxicity on two kinds of cell lines were relatively weak.The higher the purity of the organic solvent on two tumor cell had low toxicity. Conclusion The spectrum class pure methanol and acetone are effective organic solvent of fat-soluble anticancer drugs.

[Key words] MTT；Cytotoxicity；Organic solvents；Purity

在體外篩選抗腫瘤藥物時，常碰到被篩選的藥物不能溶于細(xì)胞培養(yǎng)液中，這需要借助有機溶劑才能溶解，因此，溶解樣品的有機溶劑既要能較好地溶解藥品，使之溶于培養(yǎng)液中，又需要在一定的濃度范圍內(nèi)對供試細(xì)胞株毒性盡可能小。這樣低細(xì)胞毒害的溶劑才不會對藥物的抗腫瘤作用產(chǎn)生假陽性。雖然有不少文獻(xiàn)報道不同的溶劑對不同的細(xì)胞毒害都不一樣[1-5]，但這些文獻(xiàn)很少涉及不同純度有機溶劑對細(xì)胞毒害的作用，且不少文獻(xiàn)涉及有些不溶于水的有機溶劑，因此，本文通過比較幾種常見溶于水的分析純和光譜純的有機溶劑，來測試對2株常見的細(xì)胞黑色素瘤B16和人胃癌細(xì)胞SGC-7901的毒害作用。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細(xì)胞系

黑色素瘤細(xì)胞B16、人胃癌細(xì)胞SGC-7901，從中國科學(xué)院上海藥物研究所腫瘤細(xì)胞庫引進(jìn)，并在本室長期傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物

RPMI-1640培養(yǎng)基，Gibco公司；MTT，Sigma公司；新生小牛血清，杭州四季青公司；甲醇、乙腈、四氫呋喃（THF）、二甲亞砜（DMSO）、丙酮、乙醇、甘油、異丙醇、分析純（analytical pure，AR）的為國產(chǎn)分析純，光譜純（spectrum pure，SP）購自美國天地公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，Heroes公司；酶標(biāo)儀，美國Biotech公司。

1.3 細(xì)胞毒試驗

采用MTT法進(jìn)行測試[6-7]，取對數(shù)生長期的B16、SGC-7901細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103/ml，加入96孔板中，180 μl/孔。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中放置4 h待貼壁后再加待測溶劑，每孔分別加入不同體積的溶劑（1.0、2.0、5、10、15、20 μl），然后再加入細(xì)胞培養(yǎng)也補齊200 μl/孔的體積，陰性對照為等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育36 h后，分別加入MTT 5 mg/ml，20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，輕輕吸去上層清液，再向每孔加入150 μl DMSO溶解藍(lán)紫結(jié)晶甲瓚，用酶標(biāo)儀在540 nm波長下測定各孔的OD值，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 有機溶劑對B16細(xì)胞增殖的抑制率

8種不同純度的有機溶劑對B16的毒害作用見表1，其中光譜純的丙酮對B16的傷害最小，IC50的抑制體積分?jǐn)?shù)為11.05%，其次是光譜純的甲醇，毒性最大的是分析純DMSO。當(dāng)溶劑的體積分?jǐn)?shù)為5.0%時，甲醇、丙酮對細(xì)胞的均無明顯毒害作用。

表1 不同有機溶劑對黑色素瘤B16的毒害作用（%）

“-”表示無明顯抑制

2.2 有機溶劑對SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制率

8種有機溶劑對SGC-7901的毒害作用見表2，其中光譜純乙腈的毒害作用最小，其IC50體積分?jǐn)?shù)為9.93%；其次為色譜純的甲醇IC50為9.88%，甘油對SGC-7901細(xì)胞毒害最大，當(dāng)溶劑的體積分?jǐn)?shù)為2.5%時，只有光譜純的甲醇和丙酮對細(xì)胞傷害不明顯。

表2 不同有機溶劑對人胃癌細(xì)胞SGC-7901的毒害作用（%）

“-”表示無明顯抑制

3 討論

3.1 不同溶劑對同一細(xì)胞株具有不同的細(xì)胞毒作用

在所測試的8種有機溶劑中，光譜純的甲醇和丙酮對兩種腫瘤供試細(xì)胞株毒性都比較弱，在對B16細(xì)胞毒害實驗中，其光譜純甲醇、THF、丙酮和分析純的丙酮等4種溶劑的IC50均>9%，分析純DMSO的IC50體積分?jǐn)?shù)卻只有1.41%。在SGC-7901細(xì)胞毒害實驗中，色譜純的甲醇和乙腈的IC50的體積分?jǐn)?shù)均>9%，但I(xiàn)C50的體積分?jǐn)?shù)<2%的有分析純的THF、DMSO，因此，不同有機溶劑對某一細(xì)胞株的毒害皆不相同。

3.2 同一溶劑對不同細(xì)胞株具有不同細(xì)胞毒作用

相同的溶劑對不同細(xì)胞株的毒害也有明顯不同，如乙腈和四氫呋喃在兩種細(xì)胞株表現(xiàn)的不同，光譜純乙腈和分析純的乙腈對B16的IC50僅為2.44%和2.19%，而對SGC-7901的IC50為9.93%和8.05%；THF與丙酮對二株細(xì)胞系的IC50相差也比較大，只有色譜純的甲醇對兩株細(xì)胞毒害相差不大，因此，同一溶劑對不同細(xì)胞株是其毒害作用也不一樣。

3.3 不同純度溶劑對同一細(xì)胞株有不同細(xì)胞毒作用

不同純度的溶劑細(xì)胞株的毒害也不相同，光譜純與分析純的甲醇對B16和SGC-7901的毒害IC50體積分?jǐn)?shù)相差都約1.5倍，色譜純與分析純的DMSO對B16的毒害IC50體積分?jǐn)?shù)相差2.6倍，對SGC-7901的IC50體積分?jǐn)?shù)相差2.7倍，實驗得出，光譜純的有機溶劑明顯比分析純的有機溶劑在同一濃度下對細(xì)胞毒害小。

在已報道的研究結(jié)果中，有報道甲醇、丙酮、甘油、乙醇和DMSO對某一細(xì)胞株表現(xiàn)出最低細(xì)胞毒性[1-5，8-12]，這是因為不同實驗中所選的細(xì)胞株不同，而同一種有機溶劑對不同細(xì)胞株表現(xiàn)的毒性不同；也可能是有機溶劑購買的時間較長，造成溶劑的純度發(fā)生了改變，因而表現(xiàn)出不同的細(xì)胞毒性。在篩選抗腫瘤藥物時，有必要先對已有的有機溶劑測試其對所測試細(xì)胞系的細(xì)胞毒害實驗，再選擇合適的有機溶劑，且在實驗過程中盡量購買純度高、新鮮的溶劑來溶解藥品，減少實驗誤差，還需要考慮的是，在一些有顏色的樣品中，顏色的變化也對MTT有很大的影響[12]。

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（收稿日期：2015-01-04 本文編輯：李亞聰）