吳少蓮，韓凌霞（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物與比較醫(yī)學(xué)團(tuán)隊獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150001）

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雞NK細(xì)胞相關(guān)C型凝集素樣編碼基因研究進(jìn)展

吳少蓮，韓凌霞＊
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物與比較醫(yī)學(xué)團(tuán)隊獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150001）

摘 要：雞的C型凝集素樣基因編碼包括雞自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞受體在內(nèi)的許多免疫分子。雞C型凝集素樣編碼基因分別位于自然殺傷基因復(fù)合體（NK gene complex，NKC）和主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）區(qū)域，在NKC區(qū)為CD69和CD94/NKG2，在MHC區(qū)為相鄰的B-NK和B-Lec基因。B-NK是目前唯一已證明表達(dá)于NK細(xì)胞上的凝集素樣受體，其配體尚不清楚，但是已經(jīng)證明B-NK能夠和活化的細(xì)胞上的配體結(jié)合。論文主要討論CD69、CD94/NKG、B-NK和BLec 4個基因的系統(tǒng)發(fā)育比較和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：雞；NK細(xì)胞；C型凝集素樣受體

大多數(shù)C型凝集素樣位于細(xì)胞膜表面，作為細(xì)胞表面黏附受體、信號受體和吞噬受體，通過識別糖鏈、蛋白質(zhì)和脂類等多種配體，參與細(xì)胞間的黏附、識別以及抗原物質(zhì)的吞噬清除和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，在維持機(jī)體自身穩(wěn)態(tài)等生理功能以及在感染、炎癥和腫瘤免疫等疾病過程中發(fā)揮重要作用［1］。

C型凝集素樣是一類可以和糖類可逆結(jié)合的蛋白質(zhì)，不具有酶活性，也沒有抗體功能，最初鑒定為鈣依賴型糖蛋白，包含一個保守的糖類識別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain，CRD）。還有一些蛋白質(zhì)具有CRD，但這些結(jié)構(gòu)域序列缺乏鈣結(jié)合的關(guān)鍵殘基，不能和糖類結(jié)合，被命名為C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域（C-type lectin like domain，CTLD）。C型凝集素樣是一個大的蛋白質(zhì)超家族，根據(jù)CRD（或CTLD）的位置以及CRD（或CTLD）氨基酸序列的相似程度，C型凝集素樣超家族分為7個結(jié)構(gòu)群：蛋白多糖類、肝凝集素、膠原凝集素、選擇蛋白、Ⅱ型跨膜蛋白、甘露糖受體和游離的CRD［2］。其中雞C型凝集素樣受體具有Ⅱ型跨膜蛋白特征，根據(jù)氨基酸序列特點又可分為4個亞群：亞群1表達(dá)于自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的表面，具有信號傳遞功能；亞群2代表早期淋巴細(xì)胞活化抗原；亞群3在多種白細(xì)胞表達(dá)；亞群4由多基因家族產(chǎn)生，表達(dá)于T細(xì)胞和NK細(xì)胞，大部分以主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）I類分子為配體［3］。

NK細(xì)胞是具有免疫記憶的天然免疫細(xì)胞，不表達(dá)特異性抗原識別受體，依賴細(xì)胞表面多種受體的激活調(diào)控，發(fā)揮直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的功能。Ⅱ型跨膜蛋白C型凝集素樣受體是NK細(xì)胞的一類重要受體［4-5］。雞C型凝集素樣受體基因分別位于自然殺傷基因復(fù)合體（NK gene complex，NKC）和MHC區(qū)域，在NKC區(qū)為CD69和CD94/NKG2，在MHC區(qū)為兩個相鄰的B-NK和B-Lec基因。

雞在遺傳學(xué)和基因組學(xué)方面是目前研究最成熟的非哺乳類脊椎動物，在進(jìn)化系統(tǒng)中其免疫系統(tǒng)具有獨特特征。經(jīng)過長期人工培育，目前國際上已成功培育多個MHC等位基因純合的近交系雞品系［6］，已在與多種病毒病、細(xì)菌病和寄生蟲病的致病性和免疫機(jī)制中廣泛應(yīng)用［7］，在免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中是對以近交系小鼠和大鼠為主要研究對象的重要補充，在抗病遺傳學(xué)、比較醫(yī)學(xué)研究中具有重要的地位。本文主要對雞NK細(xì)胞相關(guān)的C型凝集素樣受體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并重點關(guān)注不同MHC單倍型雞NK細(xì)胞表面的C型凝集素樣受體研究。

1　雞NKC上的C型凝集素基因結(jié)構(gòu)

通過序列比對和分子建模的方法，在雞的1號染色體鑒定出一個C型凝集素樣基因，與哺乳動物代表一種早期活化抗原的CD69同源；相距70 Mb處，存在另一個C型凝集素樣基因，最初被稱為雞CD94/NKG2同源物，因為與哺乳動物的CD94和NKG2都同源。按照哺乳動物的命名，將與人12號染色體、鼠6號染色體共線性的雞1號染色體區(qū)域也稱為NKC。哺乳動物的NKC包含多個不同的C型凝集素樣受體基因，而在雞的NKC目前只發(fā)現(xiàn)了這兩個凝集素基因。與人和小鼠的相比，其基因間構(gòu)成存在一些染色體重排，因此有可能還存在其他C型凝集素樣基因。

雞CD94/NKG2的CTLD的保守序列與人的CD94核苷酸同源性達(dá)62%，與NKG2A同源性為52%。但雞CD94/NKG2特異性單克隆抗體8G8與雞的囊細(xì)胞和胸腺細(xì)胞反應(yīng)最小，與單核外周細(xì)胞和脾幾乎所有的凝血細(xì)胞反應(yīng)，與組織中的大部分NK細(xì)胞，如胚脾、肺和腸不反應(yīng)。雞CD94/ NKG2胞外段有一個半胱氨酸殘基，胞質(zhì)尾區(qū)有一個變異的免疫受體酪氨酸激活基序（hemITAM），而hemITAM存在于Dectin-1和C型凝集素樣受體CLEC-2（C-type lectin-like receptor-2）中，但是哺乳動物的CD94/NKG2卻沒有。這些差異表明雞NKC或許不是編碼NK細(xì)胞受體的基因，也不是CD94或NKG2同源基因。因此，CD94/NKG2表示為雞CLEC-2同系物［8］。

2　MHC上C型凝集素樣基因結(jié)構(gòu)與組織分布

雞的MHC結(jié)構(gòu)組成相比其他動物簡單，在92 kb區(qū)僅有19個基因，在這個區(qū)意外發(fā)現(xiàn)2個C型凝集素樣受體基因，B-NK和B-Lec［9］，因為至今尚未在哺乳動物的MHC發(fā)現(xiàn)存在C型凝集素樣受體基因［10］。B-NK和B-Lec位置相鄰，以相反的方向轉(zhuǎn)錄。B-Lec與人的凝集素樣轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-1基因（lectin-like tanscript 1，LLT1）、鼠的C型凝集素樣相關(guān)蛋白基因（C-type lectin related，Clr）親緣關(guān)系最近，與LLT1類似，包含一個起內(nèi)吞作用的基序。在雞的MHC和Rfp-Y（包含MHC樣基因）區(qū)還發(fā)現(xiàn)了與B-Lec同源較高的其他C型凝集素樣基因，如17.5、chYLec-2、Blec3和Blec4［3］。其中Blec3在BLec和B-NK上游，類似B-Lec，其氨基酸序列與哺乳動物的早期活化抗原CD69高度同源，已證明Blec4是假基因［11］。

B-NK是唯一證明表達(dá)于雞NK細(xì)胞上的C型凝集素樣蛋白。B-NK與人的自然殺傷細(xì)胞受體蛋白家族1（natural killer receptor proteins 1，NKRP1）同源性最高，胞質(zhì)內(nèi)都具有一個功能性的免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif，ITIM）。ITIM中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化后，被蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosinphosphtase，PTP）分子上的Src同源結(jié)構(gòu)域（srchomology domain（SH2）結(jié)合，招募PTP并使之活化，抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine ki-nase，PTK）參與的激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。不同MHC單倍型雞的B-NK等位基因具有高度多態(tài)性，而其編碼區(qū)較高的非同義突變/同義突變（non-synonymous versus synonymous，dN/dS）比例導(dǎo)致多個氨基酸的突變。例如B12單倍型雞的B-NK蛋白特異性單抗僅能檢測到B12型雞NK細(xì)胞，與其他單倍型雞的NK細(xì)胞親和力幾乎低于可檢測水平［12］。而GenBank公布的B19（acc.No.AM950194.1）和B21（acc.No.AM950195.1）雞的BNK基因組序列在150nt到640nt的范圍內(nèi)存在13處核苷酸變異，全部導(dǎo)致氨基酸突變，且大多位點位于BNK受體蛋白的胞外區(qū)，位置分散［13］。

B-Lec在不同單倍型雞之間保守性較強，盡管也呈現(xiàn)出個別核甘酸變異，但是多數(shù)為同義突變?？赡芙?jīng)歷了凈化選擇，因為內(nèi)含子核苷酸的變異顯著高于外顯子［14］。有學(xué)者認(rèn)為B-NK的多態(tài)性是由病原編碼的B-Lec誘騙分子篩選形成，而不是與B-Lec共進(jìn)化［15］。B-Lec多態(tài)性缺失的原因尚不清楚。

B-NK的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）在雞的NK細(xì)胞表達(dá)，在B細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系中不表達(dá)，在淋巴組織中大量表達(dá)，與NKR-P1在這些細(xì)胞的表達(dá)情況一致，所以B-NK是目前唯一證明的表達(dá)于雞NK細(xì)胞的C型凝集素樣蛋白，有可能是雞NK細(xì)胞的受體。早期研究表明經(jīng)白介素2（interleukin，IL-2）刺激的雞NK細(xì)胞中存在B-NK mRNA，然而，利用特異性單克隆抗體表明在正常細(xì)胞的表面也檢測到B-NK蛋白，包括來自胚胎脾臟的CD8+T細(xì)胞，以及部分成年雞脾臟的CD8+αβT細(xì)胞和部分成年雞血液中CD8-的γζT細(xì)胞［11］。相比之下表達(dá)B-LecmRNA的組織分布更廣泛，佛波酯（PMA）刺激脾細(xì)胞后B-Lec表達(dá)量大量上調(diào)，與CD69和LLT1的表達(dá)相符［9，16-17］。

3　B-NK可能的配體

雞C型凝集素樣受體基因B-NK/B-Lec對與哺乳動物的NKC基因?qū)τ邢嗨频男蛄刑攸c，內(nèi)含子外顯子的組成、基因轉(zhuǎn)錄方向、組織分布以及對刺激的應(yīng)答，尤其是與小鼠NK細(xì)胞的非MHC依賴性免疫監(jiān)測體系受體-配體基因NKrp1/Clr和人的NKR-P1/LLT1，因此有人認(rèn)為雞B-NK蛋白的配體是B-Lec［14，18-21］。B-NK的胞外結(jié)構(gòu)域可以和活化脾細(xì)胞的一些配體相互作用，似乎能解釋B-Lec 是B-NK的配體，因為在活化脾細(xì)胞中B-Lec的mRNA表達(dá)量上調(diào)。但是該結(jié)構(gòu)域不能和轉(zhuǎn)染細(xì)胞上標(biāo)記的MHCⅠ類分子或者B-Lec反應(yīng)［12］。在B-NK和B-lec轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，二者可以二硫鍵連接成Ⅱ型跨膜糖蛋白的二聚體形式表達(dá)于細(xì)胞表面，盡管B-Lec的表達(dá)量不是很高［13］。目前還沒有直接證明B-NK和B-Lec存在交互作用，當(dāng)然不排除由于技術(shù)原因、親和力低，或者B-NK具有高度多態(tài)性的原因。

由于B-NK和B-Lec基因在MHC上毗鄰，以及C型凝集素樣基因的保守性，有人假設(shè)MHC祖先有一個主要的第一位點，包含涉及天然免疫應(yīng)答的受體和配體，這一位點在病原體的選擇壓力下迅速進(jìn)化。雞痘病毒（FPV）基因組包含幾個編碼C型凝集素樣序列的開放閱讀框，其中P14372能在感染細(xì)胞的表面檢測到，暗示可能作為免疫逃逸配體，阻止被NK細(xì)胞溶解［22］。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，一些雞痘病毒衍生的C型凝集素樣與哺乳動物NK細(xì)胞MHCⅠ類受體配體Ly-49同源，由此推斷鳥類中有一些同源基因可能被病毒劫持，但C型凝集素樣在感染細(xì)胞表面如何發(fā)揮作用并不清楚。Ly49的同源類似物目前只出現(xiàn)于病毒的開放閱讀框，例如雞痘病毒基因組編碼的C型凝集素樣蛋白PFV293（P14371）與CD96也具有極高的同源性。雞免疫球蛋白受體（Ig-like receptors，CHIR）或許取代了這些受體的功能［3］。

關(guān)于B-NK的作用機(jī)制，有假說提出B-NK蛋白特異性識別不同MHC單倍型雞優(yōu)勢表達(dá)的MHCⅠ類分子（BF2）。但不同單倍型的B-NK基因進(jìn)化關(guān)系（B12/B19/B14-B21-B2/B4/B15）與BF2基因（B12/B19/B4-B21-B14/B15/B19）并不一致。另一種可能是B-NK與劣勢表達(dá)的MHCⅠ類分子BF1α1結(jié)構(gòu)域α螺旋的某些特定氨基酸相互作用，然而B-NK的等位基因（B12/B19/B14-B21-B2/B4/ B15）與BF1的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（B12/B19-B14/ B15-B4/B21/B2）也不同，而且該位點的氨基酸被免疫球蛋白樣NK細(xì)胞受體（Ig-like NK receptors，KIRs）識別，且KIR在哺乳動物中是由淋巴細(xì)胞識別復(fù)合體（lymphocyte recognition complex，LRC）編碼的。盡管雞的基因組中有許多免疫球蛋白樣受體ChIRs，但哺乳動物的免疫球蛋白樣、凝集素樣NK細(xì)胞受體與MHCⅠ類分子的作用位點不同［14］。

4　結(jié)語

雞C型凝集素樣家族不僅種類多，而且多與NK細(xì)胞、免疫應(yīng)答相關(guān)。我國已選育成功MHC單倍型雞［23］，深入分析不同單倍型雞B-NK蛋白的結(jié)構(gòu)及其組成，或許能對闡明雞NK在遺傳抗性和天然免疫機(jī)制上提供某些思路。

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Advance in Chicken NK Cell Associated C-type Lectin Like Encoding Genes

WU Shao-lian，HAN Ling-xia
（Unit of Laboratory Animal and Comparative Medicine，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin，Heilongjiang，150001，China）

Abstract：Chicken C-type lectin genes encode many immunological molecules including potential chicken natural killer cell receptors.Chicken c-type lectin genes of CD69and CD94/NKG2locate in the areas of NK gene complex （NKC），and B-NK and B-Lec locate in the areas of major histocompatibility complex（MHC）.The B-NK is the only conformed c-type letine like receptor expressed on NK cells so far.The ligand of B-NK is confused，but it can combine ligand on activated cells which has been demonstrated.Here，the current knowledge on phylogenetic comparation and protein structures of the four genes were discussed.

Key words：chicken；NK cell；c-typelectin-like receptor

中圖分類號：S852.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）06-0134-04

作者簡介：吳少蓮（1989-），女，山東蓬萊人，碩士研究生，主要從事禽的免疫遺傳學(xué)研究。＊通訊作者

基金項目：科技部支撐項目（2013BAK11B02）

收稿日期：2014-11-11