王　艷，莊金秋，梅建國(guó)，姚春陽(yáng)，沈志強(qiáng)（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

?

禽偏肺病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王艷，莊金秋，梅建國(guó)，姚春陽(yáng)，沈志強(qiáng)
（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

摘 要：禽偏肺病毒病是嚴(yán)重危害家禽業(yè)的主要疾病之一。論文概述了禽偏肺病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。在細(xì)胞生物學(xué)方面，主要依靠病毒分離培養(yǎng)、ELISA法等病毒特異性抗原及其抗體的檢測(cè)等。在分子生物學(xué)方面，主要依靠國(guó)內(nèi)外相繼建立起來(lái)的RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、LAMP和核酸雜交技術(shù)等。介紹和比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和實(shí)用性，為臨床獸醫(yī)科技工作者使用快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測(cè)方法提供參考。

關(guān)鍵詞：禽偏肺病毒；檢測(cè)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；分子生物學(xué)方法

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV），又稱(chēng)為火雞鼻氣管炎病毒（Turky rhinotracheits virus，TRTV），早期稱(chēng)為禽肺病毒（Avian pneumovirus，APV）。aMPV屬于副黏病毒科、肺炎病毒亞科、偏肺病毒屬成員，是從人群中分離到人偏肺病毒（Human metapneumovirus，hMPV）后，被重新分類(lèi)為禽偏肺病毒［1］。該病毒常引起以家禽呼吸道癥狀、頭部腫脹和產(chǎn)蛋率下降為主要特征的疾病，是侵襲家禽上呼吸道的一種高度傳染性病毒，可對(duì)世界范圍內(nèi)的養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。aMPV感染火雞后可引起溫和或中度上呼吸道感染-火雞鼻氣管炎（Turky rhinotracheits，TRT）；感染肉雞可引起雞的溫和型上呼吸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病-肉雞腫頭綜合征（Swollen head sydrome，SHS）；感染產(chǎn)蛋雞可導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降、孵化率降低等［2］。aMPV于1978年首次在南非報(bào)道之后，現(xiàn)已在世界許多國(guó)家都有分布。我國(guó)沈瑞忠等于1998年首次分離并報(bào)道了該病毒［3］。目前，aMPV分為A、B、C、D 4個(gè)亞型，其中A亞型和B亞型在世界各地均有報(bào)道，C亞型和D亞型分別在美國(guó)和法國(guó)有報(bào)道［4］。aMPV感染沒(méi)有特征性的臨床表現(xiàn)和病變，且常會(huì)與禽傳染性支氣管炎病毒、支原體、禽波氏桿菌、鼻氣管鳥(niǎo)桿菌和禽流感等呼吸道病原體相互混淆。試驗(yàn)證明當(dāng)aMPV與其他病原協(xié)同作用時(shí)可以加重和延長(zhǎng)臨床癥狀并增加病死率。近年來(lái)，aMPV感染給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的動(dòng)物福利問(wèn)題，尤其是一些火雞飼養(yǎng)大國(guó)，從而引起許多國(guó)家的高度關(guān)注。目前對(duì)aMPV感染尚無(wú)有效的治療藥物和方法，因此，做好該病的預(yù)防控制，特別是快速而準(zhǔn)確的診斷方法的建立受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本文就aMPV檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展方面做一綜述，以期對(duì)禽偏肺病毒病的深入研究和疾病防控提供參考。

1　病毒分離與鑒定

病料多采集自感染aMPV病禽的氣管、肺臟以及眼鼻分泌物，或鼻竇、鼻甲刮下的組織。應(yīng)盡早對(duì)樣品進(jìn)行采集并立即送檢，因?yàn)閍MPV可能最多在鼻竇和鼻甲中存在6d～7d。用臨床癥狀較為嚴(yán)重的雞進(jìn)行病毒的分離很少有成功的先例，一般認(rèn)為臨床癥狀的出現(xiàn)是由aMPV感染后繼發(fā)感染其他病原微生物所導(dǎo)致的。

1.1雞胚培養(yǎng)

6日齡～8日齡SPF雞胚或火雞胚可用于病毒的分離。經(jīng)卵黃囊接種aMPV后第8d收集尿囊液和卵黃囊膜進(jìn)行勻漿，接種繼代培養(yǎng)。經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后，胚胎發(fā)育受阻，胚體表面出血，甚至死亡。這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要連續(xù)傳代很多次才能穩(wěn)定的致死胚，而且往往分離病毒失敗。1980年，南非最早的aMPV毒株是采用這種方法得到的。C亞型的aMPV也是采用這種方法分離得到的［5］。

1.2氣管環(huán)培養(yǎng)

適合的病毒培養(yǎng)物首選為即將岀殼的SPF雞胚或火雞胚的氣管環(huán)，也可用無(wú)aMPV抗體的1日齡～2日齡的雛雞制作氣管環(huán)培養(yǎng)物。這種培養(yǎng)物可以維持?jǐn)?shù)周，接種樣品之后觀(guān)察纖毛運(yùn)動(dòng)的停滯，一般在aMPV感染1周后纖毛活動(dòng)停滯。而觀(guān)察到恒定的病變時(shí)，還要繼續(xù)培養(yǎng)幾代。一些早期分離到的A亞型和B亞型aMPV都是通過(guò)用這種方法得到的。在氣管環(huán)培養(yǎng)（TOC）中，A和B亞型aMPV感染10d后造成纖毛活動(dòng)停滯，但在接種后3d～5d里病毒滴度就達(dá)到高峰，因此野外材料在接種TOC后間隔3d～4d進(jìn)行盲傳，每次盲傳后留一部分TOC用作纖毛運(yùn)動(dòng)活性檢查。但是，TOC并不適合C亞型病毒的分離，因其不能使纖毛運(yùn)動(dòng)停滯。有研究表明，利用TOC法培養(yǎng)，aMPV傳代98次后病毒的毒力仍沒(méi)有丟失。相比之下，aMPV在其他細(xì)胞上傳代，可迅速使病毒毒力致弱。因此，使用aMPV弱毒株作為疫苗，很可能出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，從而引起免疫個(gè)體發(fā)病，甚至出現(xiàn)散毒的危險(xiǎn)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

aMPV可在多種原代和傳代系細(xì)胞內(nèi)增殖。最常用原代細(xì)胞有雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）或火雞胚成纖維細(xì)胞（TEF）和雞胚肝細(xì)胞（CEL）；傳代系細(xì)胞有雞胚成纖維細(xì)胞（DF-1）和非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）等。鵪鶉成纖維細(xì)胞（QT-35）也曾被用于美國(guó)C亞型aMPV的早期分離。另外，Patnayak D P等［6］證明了aMPV也可在黑長(zhǎng)尾猴腎細(xì)胞（BGM-70）、羅猴胎兒細(xì)胞（MA-104）、鼠源的麥科伊細(xì)胞（Mc-Coy）、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）以及牛胚腎細(xì)胞（MDBK）等傳代細(xì)胞系上增殖。病毒在細(xì)胞中經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后可產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），其特征是細(xì)胞分散、變圓，并有合胞體形成。該方法在病毒早期分離中不一定成功，需要盲傳多代才能出現(xiàn)一致的CPE。但是aMPV一旦適應(yīng)了在雞胚和TOC上生長(zhǎng)，可在培養(yǎng)細(xì)胞上獲得高滴度的病毒，培養(yǎng)7 d內(nèi)可在細(xì)胞上呈現(xiàn)典型的合胞體CPE。對(duì)分離到的aMPV可通過(guò)電鏡或免疫化學(xué)方法作進(jìn)一步鑒定。

2　免疫血清學(xué)方法

2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

由于aMPV的分離鑒定比較困難，因此血清學(xué)方法常被用于商品家禽及其他禽類(lèi)aMPV感染的診斷。血清學(xué)檢測(cè)方法中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是最常用的檢測(cè)方法之一，該法操作簡(jiǎn)便，僅需要采集少量血清便可以對(duì)樣品進(jìn)行快速、靈敏的檢測(cè)?，F(xiàn)在國(guó)外已經(jīng)有多種商品化和自主研制的aMPV抗體檢測(cè)試劑盒問(wèn)世，為臨床監(jiān)測(cè)提供了有利的工具。該方法可以同時(shí)檢測(cè)大量的血清，有一些試劑盒甚至可以檢測(cè)多種禽源的不同亞型aMPV。然而，在使用許多試劑盒檢測(cè)不同亞型的aMPV時(shí)，敏感性和特異性方面卻沒(méi)有保證。主要原因是用來(lái)包被ELISA板的抗原變異和抗原不純。Hafez H M等［7］分別應(yīng)用3種不同的aMPV毒株作為包被抗原用于血清樣品檢測(cè)，從而對(duì)ELISA試劑盒的敏感性進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并不是所有的包被抗原都可以檢測(cè)到血清中的aMPV抗體。如果用異源毒株包被ELISA板，可能檢測(cè)不到由aMPV疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體。加入A亞型或B亞型抗原的ELISA試劑盒對(duì)aMPV C亞型毒株抗體檢測(cè)不敏感。也就是說(shuō)，一般情況下，當(dāng)用異株aMPV作為包被抗原，即使通過(guò)病毒中和試驗(yàn)出現(xiàn)很近的關(guān)系時(shí)，也不能很好的用于aMPV的抗體檢測(cè)。一些競(jìng)爭(zhēng)性ELISA試劑盒加入了入aMPV特異性單克隆抗體，為不同禽種的血清檢測(cè)提供了可行性。然而，這種試劑盒不適用于C亞型aMPV美國(guó)分離株抗體的檢測(cè)。近期，包含aMPV科羅拉多州分離株（Colorado株）和明尼蘇達(dá)州分離株（Minnesota株）全病毒抗原的ELlSA試劑盒已經(jīng)被研制和評(píng)估，這些試劑盒通過(guò)表達(dá)的M蛋白和N蛋白建立的雙抗原夾心ELISA檢測(cè)C亞型的MPV的抗體更加敏感和特異。我國(guó)對(duì)aMPV的研究相對(duì)匱乏，陳琳等［8］將純化的B亞型aMPV重組G蛋白作為診斷抗原，建立了檢測(cè)B亞型aMPV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。該方法具較高的特異性和較好的可重復(fù)性，與IDEXX司生產(chǎn)的aMPV抗體檢測(cè)試劑盒符合率為96.0%，可用于aMPV的血清學(xué)檢測(cè)。應(yīng)用該方法對(duì)山東省部分地區(qū)的商品蛋雞、商品肉雞和肉種雞進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，表明aMPV感染在山東省部分地區(qū)的雞群中是廣泛存在的，且以肉種雞的陽(yáng)性率為最高，商品蛋雞陽(yáng)性率最低。這一研究為aMPV診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)，并為該病的診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。贠炳嶺［9］建立了檢測(cè)aMPV抗體的間接ELISA方法，該方法與IDEXX同類(lèi)ELISA試劑盒符合率為97.01%，適用aMPV的血清學(xué)調(diào)查和臨床樣品檢測(cè)。

2.2病毒中和試驗(yàn)

可以應(yīng)用敏感的細(xì)胞培養(yǎng)和TOC同時(shí)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的病毒中和試驗(yàn)對(duì)aMPV抗體進(jìn)行檢測(cè)。A亞型和B亞型aMPV可以發(fā)生交叉反應(yīng)。病毒中和試驗(yàn)（VN）耗時(shí)、昂貴，不適合禽場(chǎng)的大規(guī)模血清學(xué)篩選。

2.3免疫熒光試驗(yàn)（IFA）

熒光抗體檢測(cè)是一種非常好的檢測(cè)方法，已經(jīng)有很多相關(guān)報(bào)道，如Naylor C J等［10-11］，但是該方法并不適用于大量血清樣品中aMPV抗體的檢測(cè)。

2.4乳膠凝集試驗(yàn)

乳膠凝集試驗(yàn)具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，是一種適于基層單位檢測(cè)aMPV的可靠方法。裴蘋(píng)蘋(píng)等［12］建立了aMPV乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法并將其用于臨床病料的檢測(cè)。aMPV抗體致敏乳膠無(wú)自凝性、特異性強(qiáng)、質(zhì)量穩(wěn)定、檢測(cè)結(jié)果可靠，為aMPV的快速診斷提供了一種簡(jiǎn)單、有效的方法。

3　分子生物學(xué)方法

3.1RT-PCR技術(shù)

RT-PCR技術(shù)是檢測(cè)aMPV的常用方法。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)時(shí)需要充分考慮當(dāng)?shù)氐牧餍衼喰?，以便為是否需要設(shè)計(jì)亞型特異性引物提供參考。例如，在歐洲有4種亞型，同時(shí)在美國(guó)就只有一種C亞型。通常以F、G和M基因作為目的基因建立的RT-PCR方法，不能用于檢測(cè)所有的亞型。而針對(duì)N基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物建立的RT-PCR方法，能夠檢測(cè)A、B、C和D四個(gè)亞型。陽(yáng)性樣品可以進(jìn)一步通過(guò)亞型特異性引物、序列分析和限制性片段長(zhǎng)度分析等確定其亞型。Woade A A等［13］利用RT-PCR方法對(duì)我國(guó)南方部分地區(qū)A亞型aMPV的感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，陽(yáng)性檢出率高達(dá)39%，但是B亞型為陰性。Ongor H M等［14］利用RT-PCR方法對(duì)土耳其火雞進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為2.9%。陳琳等［15］根據(jù)B亞型aMPV F基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了針對(duì)B亞型aMPV的RT-PCR檢測(cè)方法。應(yīng)用該方法對(duì)山東省492份具有呼吸道癥狀的商品肉雞的肺臟病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果aMPV陽(yáng)性檢出率為43.09%（212/492），隨機(jī)挑取11份進(jìn)行克隆測(cè)序及序列分析，結(jié)果顯示所擴(kuò)增到的陽(yáng)性產(chǎn)物均為B亞型aMPV。這表明了aMPV在山東省商品肉雞群中普遍存在，且陽(yáng)性率較高，應(yīng)該引起足夠的重視。薛聰?shù)龋?6］建立了一種適用于B亞型aMPV的套式RT-PCR檢測(cè)方法。應(yīng)用本方法對(duì)采自山東省不同地區(qū)的64份可疑臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為57.8%（37/64）。其所建立的套式RTPCR檢測(cè)方法具有特異、敏感、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，為B亞型aMPV的快速診斷以及深入研究提供了更加可靠的方法。

3.2熒光定量RT-PCR技術(shù)

熒光定量RT-PCR技術(shù)比常規(guī)的RT-PCR靈敏度更高、特異性更強(qiáng)，穩(wěn)定性更好，尤其適用于病毒感染的早期診斷。Guionie A O等［17］報(bào)道，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR可作為aMPV檢測(cè)的強(qiáng)有力的工具，用于aMPV各亞型的鑒定和量化。Kwon J S等［18］利用實(shí)時(shí)熒光定量方法對(duì)韓國(guó)A亞型和B亞型aMPV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果商品肉雞、肉種雞和蛋雞的陽(yáng)性檢出率分別為2.6%、3.8%和1%。鞠小軍［19］利用RT-PCR擴(kuò)增出B亞型aMPV F基因的目的片段，并將其導(dǎo)入克隆菌中制備出陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，建立了B亞型aMPV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法具較高的特異性、靈敏度和較好的可重復(fù)性，可用于B亞型禽偏肺病毒的臨床樣品檢測(cè)。王麗榮等［20］建立了針對(duì)A、B和C 3個(gè)亞群aMPV的熒光定量RT-PCR方法，靈敏度是常規(guī)RT-PCR方法的100倍，適用于病原學(xué)檢測(cè)，該方法為該病的早期診斷以及感染程度的定量分析奠定了基礎(chǔ)。熒光定量RT-PCR檢測(cè)aMPV的方法不僅能進(jìn)行定性檢測(cè)，更能準(zhǔn)確定量，這就為aMPV感染、增殖規(guī)律的研究及病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

3.3核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是一種易于判定結(jié)果的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，它是一種基于分子雜交技術(shù)的檢測(cè)方法，可以檢測(cè)核酸樣品中是否存在特定目的基因。這種方法特異性較強(qiáng)，不需要特殊的儀器，適用于大量樣品的檢測(cè)，而且結(jié)果便于觀(guān)察。目前常使用的探針標(biāo)記方法包括放射性同位素法、光敏生物素法、地高辛標(biāo)記法等。孫靜等［21］利用地高辛標(biāo)記的核酸探針對(duì)山東部分地區(qū)臨床健康肉雞群的多種呼吸道病原進(jìn)行檢測(cè)，aMPV檢出率高達(dá)36.87%，而且多重感染現(xiàn)象比較嚴(yán)重，由此造成的損失難以估計(jì)。陳琳等［22］根據(jù)B亞型aMPV的F基因保守序列設(shè)計(jì)引物并用地高辛標(biāo)記，制備出了地高辛標(biāo)記的aMPV核酸探針。應(yīng)用制備的探針對(duì)山東省不同地區(qū)的605份商品肉雞和122份商品肉鴨進(jìn)行了核酸探針檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率分別為36.59%和34.51%。表明aMPV在山東省商品肉雞及肉鴨中普遍存在，且陽(yáng)性率較高。核酸探針技術(shù)特異性強(qiáng)，敏感性好，但是該法操作較為繁瑣，且不能對(duì)核酸進(jìn)行進(jìn)一步研究和探索。

3.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

RT-LAMP技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可應(yīng)用于疾病的臨床診斷。鞠小軍［19］針對(duì)B亞型aMPV的F基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)RT-LAMP引物，建立了B亞型aMPV的RT-LAMP檢測(cè)方法。利用該方法對(duì)20份疑似aMPV樣品進(jìn)行檢測(cè)，其陽(yáng)性檢出率為10%。結(jié)果顯示，該方法具有較高的靈敏度和特異性，可用于B亞型aMPV的臨床樣品檢測(cè)。RT-LAMP技術(shù)在B亞型aMPV的快速檢測(cè)和防治方面發(fā)揮一定的作用，為aMPV的檢測(cè)及疾病流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠方法。

4　小結(jié)

目前，aMPV感染火雞和雞導(dǎo)致的疾病已成為危害世界許多國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。特別是在火雞養(yǎng)殖業(yè)，由aMPV引起的呼吸道疾病所造成的危害僅次于禽流感病毒，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。aMPV作為家禽呼吸道病原體之一，在國(guó)外受到了高度的關(guān)注，尤其是一些火雞飼養(yǎng)大國(guó)，但是在國(guó)內(nèi)的研究卻相對(duì)滯后。郭龍宗等［23］對(duì)我國(guó)等膠東地區(qū)不同周齡種雞群的血清，通過(guò)aMPV抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在膠東種雞群中普遍存在禽肺病毒感染，多個(gè)雞群血清學(xué)達(dá)到100%的陽(yáng)性率，雞群普遍在開(kāi)產(chǎn)前已經(jīng)感染該病，最早的感染時(shí)間在6周齡～12周齡。徐仕忠等［24］通過(guò)對(duì)aMPV流行病學(xué)研究的文獻(xiàn)資料及部分雞群aMPV感染的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果證實(shí)，aMPV感染已經(jīng)在中國(guó)的雞群中廣泛流行。在臨床上，雖然單純aMPV感染雞不一定表現(xiàn)明顯癥狀，但可以加重其他病原因子所致腫頭、呼吸道病和產(chǎn)蛋下降等問(wèn)題的嚴(yán)重程度并增加病死率。aMPV的感染也可造成全身性免疫抑制反應(yīng)aMPV感染家禽后，常伴隨著細(xì)菌的繼發(fā)性感染，可使病死率增加25%～40%，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，疫苗接種和嚴(yán)格的生物安全手段是控制aMPV疾病的主要措施，但現(xiàn)有疫苗的安全性和有效性仍有待于進(jìn)一步提高。因此加強(qiáng)對(duì)該病毒的研究，建立有效的診斷方法，是預(yù)防和控制該病的有效措施之一。對(duì)預(yù)防該病的發(fā)生，減少經(jīng)濟(jì)損失，保護(hù)和促進(jìn)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。目前針對(duì)aMPV已建立了多種檢測(cè)方法，這些方法的使用極大的方便了該病的及早診斷，使得疫情得以有效控制。然而這些方法各自存在不同的優(yōu)缺點(diǎn)或苛刻要求，如有的存在操作繁瑣、受檢測(cè)材料限制、有的試驗(yàn)周期較長(zhǎng)、有的對(duì)試驗(yàn)儀器及檢測(cè)人員技術(shù)要求高等，這就需要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員根據(jù)各自條件，綜合選擇并建立合適的檢測(cè)方法，及時(shí)、準(zhǔn)確、快速地監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)行的發(fā)生、發(fā)展和流行，并提供有效的防控措施。另外，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和人們對(duì)aMPV研究的不斷深入，相信不久的將來(lái)，更多更為高效、敏感、特異、快速、簡(jiǎn)易而且價(jià)廉的檢測(cè)方法將會(huì)被建立起來(lái)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 熊永忠，郭太杰.對(duì)禽偏肺病毒的認(rèn)識(shí)［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2011（3）：1-2.

［2］ 閻 旭，韋 莉，王 菁，等.A型禽偏肺病毒F蛋白的原核表達(dá)與抗原性分析［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2014，50（3）：6-9.

［3］ 沈瑞忠，曲立新，于康震，等.禽肺病毒的分離鑒定［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21（1）：76-77.

［4］ 胡海霞，趙 偉，于慶忠.禽偏肺病毒分子生物學(xué)及基因工程疫苗研究進(jìn)展［J］.中國(guó)家禽，2012，34（12）：1-5.

［5］ Panigrahy B，Senne D A，Pedersen J C，et al.Experimental and serologic observations on avain pneumovirus（APV/turkey/ Colorado/97）infection in turkeys［J］.Avain Dis，2000，44（1）：17-22.

［6］ Patnayak D P，Tiwari A，Goyal S M.Growth of vaccine strains of avian pneumovirus in different cell lines［J］.Avian Pathol，2005，34：123-126.

［7］ Hafez H M.Comparative investigation on different turkey rhinotracheitis（TRT）virus isolates from different countries［J］. Dtsch Tierarztl Wochenschr，1992，99（12）：486-488.

［8］ 陳 琳，刁有祥，鄒金峰，等.B亞型禽偏肺病毒重組G蛋白間接ELISA方法的建立及應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（3）：300-335.

［9］ 贠炳嶺.禽偏肺病毒檢測(cè)方法的建立及流行病學(xué)調(diào)查［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013：27-33.

［10］ Naylor C J，Jones R C.Turkey rhinotracheitis：a review［J］. Vet Bul，1993，63：439-449.

［11］ Cook J K A，Cavanagh D.Detection and differentiation of avian pneumoviruses（metapneumoviruses）［J］.Avian Pathol，2002，31：117-132.

［12］ 裴蘋(píng)蘋(píng)，刁有祥，孫曉艷，等.禽偏肺病毒乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，42（2）：24-28.

［13］ Woade A A，Ducatez M F，Hubschen J M.Avian metapneumovirus subtype A in China and subtypes A and B in nigeria ［J］.Avian Dis，2008，52：502-506.

［14］ Ongor H M.Detection of avian metapneumovirus subtypes in turkeys using RT-PCR［J］.Vet Rec，2010，166：363-366.

［15］ 陳 琳，刁有祥，鄒金峰.禽偏肺病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（7）：971-974.

［16］ 薛 聰，刁有祥，唐 熠，B亞型禽偏肺病毒逆轉(zhuǎn)錄套式PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（2）：171-174.

［17］ Guionie A O，Toquin A D，Sellal B E，et al.Laboratory evaluation of a quantitative real-time reverse transcription PCR assay for the detection and identification of the four subgroups of avian metapneumovirus［J］.J Virol Meth，2007，139：150-158.

［18］ Kwon J S，Lee H J，Jeong S H.Isolation and characterization of avian metapneumovirus from chickens in Korea［J］.J Vet Sci，2010，11（1）：59-66.

［19］ 鞠小軍.B亞型禽偏肺病毒檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用［D］.山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012：24-43.

［20］ 王麗榮，刁有祥，唐 熠，等.B亞型禽偏肺病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，34（1）：34-38.

［21］ 孫 靜，刁有祥，劉 霞，等.肉雞呼吸道病料中AIV、NDV、IBV、aMPV共感染的檢測(cè)［C］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第二屆中國(guó)獸醫(yī)臨床大會(huì)論文集，吉林長(zhǎng)春，2010：1071-1073.

［22］ 陳 琳，刁有祥，鞠小軍，等.禽偏肺病毒地高辛核酸探針的制備與應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（1）：23-27.

［23］ 郭龍宗，曲立新.種雞禽肺病毒感染的血清學(xué)調(diào)查［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（4）：149-150.

［24］ 徐仕忠，秦 云，于 鵬.中國(guó)雞群禽偏肺病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告［J］.中國(guó)家禽，2013，35（6）：59-60.

Progress on Detection Methods of Avian Metapneumovirus

WANG Yan，ZHUANG Jin-qiu，MEI Jian-guo，YAO Chun-yang，SHEN Zhi-qiang
（Shandong Binzhou Animal Science &Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong，256600，China）

Abstract：Avian metapneumovirus（aMPV）disease is one of the main infectious diseases，which is seriously harmful to poultry industry.The laboratory methods for detecting aMPV were summarized in this paper. In the cell biology aspect，the detection of aMPV mainly depends on virus isolation and culture，specific antigen and antibody examination such as ELISA.In the molecular biology aspect，the detection methods mainly depend on RT-PCR and real-time RT-PCR，LAMP and nucleic acid hybridization.The advantages and disadvantages，and the practicality of the several of methods were introduced and compared.It can provide references for use of rapid，simple，accurate and practical methods to detect avian metapneumovirus.

Key words：Avian metapneumovirus；detection；ELISA；moleoular biology method

作者簡(jiǎn)介：王 艷（1976-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士，助理研究員，主要從事獸醫(yī)微生物研究及動(dòng)物用疫苗研制。

收稿日期：2014-10-16

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.657

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）06-0130-05