占育華 崔涵 劉濟遠 周偉 闕林 唐休發(fā)

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科（四川大學），成都 610041

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最為常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐漸增加的趨勢。研究表明糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）能磷酸化多種底物，負性調(diào)節(jié)多條信號通路。多種惡性腫瘤的發(fā)生與GSK-3β均密切相關(guān)，如喉癌、食道癌、惡性黑色素瘤等[1-2]。核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）作為抗細胞凋亡基因B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）的上游調(diào)控基因[3]，是具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB的異?；罨谀[瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中有著十分重要的作用[4-5]，但目前關(guān)于NF-κB/Bcl-2信號通路與GSK-3β在OSCC發(fā)生發(fā)展中的作用及這幾種因子之間相互關(guān)系的研究較少見。本研究選用免疫組織化學方法檢測不同組織學分化程度的鱗癌組織和OSCC癌旁組織中GSK-3β、NFκB及Bcl-2的表達情況，初步探討GSK-3β、NF-κB及Bcl-2與OSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以及這幾種蛋白在OSCC中表達的相互關(guān)系，研究其作為OSCC的標志物或者預測因子的可能性，為臨床上對OSCC進行早期診斷和治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 標本來源

收集2007—2011年四川大學華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為口腔鱗狀細胞癌的病例55例，同時伴發(fā)其他口腔疾病者不納入本實驗的范圍，所有納入病例術(shù)前均未行放化療。55例患者中，男39例，女16例；根據(jù)組織學分化程度分類，鱗狀細胞癌一級25例，二級18例，三級12例；臨床分期Ⅰ期14例，Ⅱ期12例，Ⅲ期15例，Ⅳ期14例。在55例患者中隨機選取10例，取癌旁組織（腫瘤邊緣約1 cm）作為對照組。所有標本均在離體后經(jīng)甲醛固定，取材，逐級脫水后采用石蠟包埋。

1.2 主要試劑

兔抗人p-GSK-3β（Ser9）多克隆抗體（北京博奧森生物科技有限公司），兔抗人Bcl-2多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗人NF-κB多克隆抗體、免疫組織化學羊抗兔試劑盒（SP-9001）及濃縮型DAB試劑盒（ZL1-9031）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本切片 將所收集的病理標本石蠟塊常規(guī)切片，每個標本切4 μm厚連續(xù)切片，切5張，1張采用蘇木精-伊紅染色進行復查。

1.3.2 免疫組織化學SP法染色 先通過預實驗明確p-GSK-3β抗體的最佳稀釋濃度是1︰200，NF-κB抗體的最佳稀釋濃度是1︰300，Bcl-2抗體最佳稀釋濃度是1︰100。SP法染色主要步驟為：烤片；脫蠟；梯度乙醇脫水；3%H2O2溶液阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶；抗原修復；正常山羊血清封閉；滴加一抗孵育（用PBS液代替一抗作陰性對照），PBS液洗3次；滴加生物素化標記二抗孵育，PBS液洗3次；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，PBS液洗3次；DAB顯色液染色，水洗；蘇木素復染，水洗；1%鹽酸乙醇分色，水洗；氨水返藍，水洗；最后常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。

1.4 結(jié)果觀察

在200倍及400倍的光學顯微鏡下觀察切片的染色反應。胞漿或（和）胞核中呈棕黃色或棕褐色深染的細胞為GSK-3β、NF-κB及Bcl-2陽性表達的細胞。實驗結(jié)果采用Fromowitz等[6]的綜合計分法進行計分。每張切片隨機選取5個高倍視野（×400）計數(shù)，陽性細胞表達率=（陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)）×100%。無陽性細胞計0分，陽性細胞表達率小于等于25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。著色強度以多數(shù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色特性計分，無著色計0分，呈淡黃色計1分，呈棕黃色計2分，呈棕褐色計3分。根據(jù)2種計分之和進行評價，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中度陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。所有切片均采用雙盲法閱片。進行相關(guān)性分析時，將“-”、“+”歸為弱表達，“++”、“ +++”歸為強表達。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組標本GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表達陽性率比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率。以α=0.05作為檢驗標準，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表達相關(guān)性采用趨勢性檢驗及一致性檢驗分析，以α=0.05作為檢驗標準，P<0.05、κ>0.6為有統(tǒng)計學意義。表達強度比較采用等級資料的秩和檢驗，以α=0.05作為檢驗標準。

2 結(jié)果

2.1 GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在癌旁組織、OSCC中的表達情況

GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在癌旁組織及OSCC中的表達見圖1、表1。1）GSK-3β在OSCC中的陽性表達主要定位于癌細胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色至棕褐色深染；NF-κB在OSCC中的陽性表達部分定位于癌細胞胞漿內(nèi)，部分定位于胞核中，呈棕黃色甚至棕褐色深染；Bcl-2在OSCC中的陽性表達主要定位于癌細胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色甚至棕褐色深染。2）GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在OSCC癌旁組織中分別只有40%、40%、20%呈弱陽性表達；而在OSCC中其陽性表達率分別為98.18%、94.55%、96.36%，且以強陽性表達為主（表1）。GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在OSCC中的表達與癌旁組織中的表達之間具有統(tǒng)計學差異（P<0.01），在OSCC中的表達高于在癌旁組織中的表達。

圖1 GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在癌旁組織及OSCC中的表達 免疫組織化學× 400Fig 1 Εxpression of GSK-3β,NF-κB and Bcl-2 in paracancerous and OSCC immunohistochemistry× 400

表1 GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在癌旁組織及OSCC中的表達Tab 1 Expression of GSK-3β,NF-κB and Bcl-2 in paracancerous and OSCC

2.2 OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表達與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表2。如表2所示，GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表達與患者的年齡、性別以及臨床分期無明顯關(guān)系（P＞0.05）。Bcl-2在不同組織學分化程度的OSCC組織中的表達有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），隨著分化程度級別的增加，強表達率逐漸升高，而GSK-3β與NF-κB在不同組織學分化程度的OSCC中的表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表2 OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2的表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 2 Relationship between expressions of GSK-3β,NF-κB and Bcl-2 in OSCC and clinicopathological parameters

2.3 OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表達的相關(guān)性分析

GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表達相關(guān)性的兩兩比較見表3。如表3所示，經(jīng)過趨勢性檢驗及一致性檢驗分析，GSK-3β、NF-κB及Bcl-2在OSCC中的表達均兩兩相關(guān)（P<0.05）。其中，GSK-3β和NF-κB表達顯著相關(guān)且一致性較高（P<0.05，κ>0.6）；GSK-3β和Bcl-2表達顯著相關(guān)且一致性較高（P<0.05，κ>0.6）；NF-κB和Bcl-2表達顯著相關(guān)且中度一致性（P<0.05，0.4<κ<0.6）。

表3 OSCC中GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表達相關(guān)性的兩兩比較Tab 3 Multiple comparison between expressions of GSK-3β,NF-κB and Bcl-2 in OSCC

3 討論

近年來學者[7-10]研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞模型中通過基因敲除或沉默GSK-3β后，NF-κB信號通路的活性受到了抑制，從而下調(diào)其靶基因Bcl-2抗凋亡蛋白的表達，增強腫瘤細胞的凋亡。這些證實了NFκB/Bcl-2信號通路和GSK-3β與OSCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

GSK-3是一種能磷酸化多種信號調(diào)節(jié)蛋白和各種轉(zhuǎn)錄因子的絲氨酸/蘇氨酸激酶[11-12]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，多數(shù)病理過程與GSK-3β磷酸化修飾調(diào)節(jié)有關(guān)，且在上皮源性的癌組織中發(fā)現(xiàn)GSK-3β（Ser9）高表達。GSK-3β能抑制一些腫瘤細胞的生長（如喉癌、食道癌、惡性黑色素瘤等），同時也能夠促進某些腫瘤的生長（如白血病、卵巢癌、腎細胞癌等）[1-2]。在OSCC中，GSK-3β作為抑制腫瘤生長的功能存在，能夠檢測到GSK-3β（Ser9）的高表達[13]，且在激活GSK-3β后能逆轉(zhuǎn)上皮間葉轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，ΕMT）過程[14]。本研究結(jié)果顯示，GSK-3β在癌旁組織組中的表達較弱，而在OSCC中則呈強陽性表達，GSK-3β在OSCC組的表達顯著高于癌旁組，但與OSCC的組織學分化程度無明顯相關(guān)。這表明，在OSCC組織中存在GSK-3β的高表達，其處于失活狀態(tài)，而且GSK-3β能夠抑制OSCC的生長[2]，可知GSK-3β的異?；罨cOSCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

NF-κB是一種可與免疫球蛋白輕鏈基因增強子κB序列特異性結(jié)合并促使κ鏈轉(zhuǎn)錄以及輕鏈形成的一種細胞因子，當細胞受到刺激時，IκB激酶（IκB kinase，IκK）復合體能使IκB發(fā)生磷酸化而降解，從而使NF-κB游離出來并在胞核內(nèi)聚集發(fā)生活化[4,15]。本研究顯示，NF-κB在癌旁組織中的表達較弱，而在OSCC中則呈強陽性表達，NF-κB在OSCC組的表達顯著高于癌旁組，但與OSCC的組織學分化程度無明顯相關(guān)。NF-κB的活化通過調(diào)控誘導抗凋亡蛋白的靶基因的表達而抑制細胞凋亡。在多種腫瘤細胞中，NF-κB的持續(xù)過度活化暗示NF-κB的活化在腫瘤的發(fā)生中有著重要作用。

Bcl-2家族是一類高度保守的蛋白，與細胞凋亡密切相關(guān)，按功能可以分為以Bcl-2為代表的抗細胞凋亡蛋白及以Bax為代表的促進細胞凋亡基因[16]。在腫瘤細胞中，Bcl-2作為抗凋亡基因通過抑制各種凋亡刺激信號從而抑制腫瘤細胞凋亡。研究[3]表明NF-κB是Bcl-2的上游調(diào)控基因。本實驗顯示，Bcl-2在癌旁組織中的表達較弱，而在OSCC中則強陽性表達，Bcl-2在OSCC組的表達顯著高于癌旁組，且與OSCC的組織學分化程度顯著相關(guān)。這表明在OSCC中存在Bcl-2的持續(xù)活化，而Bcl-2作為抗凋亡基因在很大程度上抑制了腫瘤的凋亡，與OSCC的發(fā)展密切相關(guān)。

本文研究結(jié)果與其他學者對腎細胞癌、結(jié)腸癌以及前列腺癌的研究結(jié)果相似。在腎細胞癌中，抑制GSK-3β的活性后，NF-κB靶基因Bcl-2的表達下調(diào)[17]。在結(jié)腸癌及前列腺癌中，抑制GSK-3β活性能使NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)，從而抑制了腫瘤細胞的生長[18-19]。這些研究均提示，NF-κB/Bcl-2信號通路與GSK-3β可能與一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性。另外本研究還分析了GSK-3β、NF-κB及Bcl-2表達之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其兩兩之間的表達均顯著相關(guān)（P<0.05），進一步驗證了NF-κB/Bcl-2信號通路與GSK-3β在OSCC中的存在。

綜上，本研究結(jié)果顯示NF-κB/Bcl-2信號通路和GSK-3β在OSCC中持續(xù)激活，提示這種異常活化可能與OSCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對其表達水平進行檢測能對OSCC的早期診斷和判斷預后提供幫助；但要闡明NF-κB/Bcl-2信號通路和GSK-3β與OSCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其在此過程中的具體作用機制，尚有待進一步深入的研究。GSK-3β對NF-κB/Bcl-2信號通路的影響可能使其在分子水平上為頭頸部鱗癌的基因治療、新的抗腫瘤藥物的開發(fā)提供新的靶點。

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