馮明光，劉忠堂，王立強(qiáng)，徐 麗，楊海濤，王 健，王海洋，秦士新

鈦表面TiO2納米管抗菌覆膜藥物釋放動(dòng)力學(xué)表征及其抗菌活性體外研究

馮明光1，劉忠堂2，王立強(qiáng)3，徐 麗1，楊海濤1，王 健1，王海洋1，秦士新1

目的 明確鈦表面TiO2納米管抗菌覆膜藥物釋放動(dòng)力學(xué)特征，并通過體外試驗(yàn)測(cè)試其抗菌活性。方法 電化學(xué)氧化法在鈦金屬表面構(gòu)建TiO2納米管表層，利用凍干法加載慶大霉素，在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行藥物釋放動(dòng)力學(xué)研究。選擇標(biāo)準(zhǔn)表皮葡萄球菌菌株，分別在負(fù)載和未負(fù)載藥物納米管及純鈦3種鈦表面進(jìn)行培養(yǎng)，通過觀察細(xì)菌粘附和活性菌落存活情況進(jìn)行表面抗菌活性對(duì)比研究。結(jié)果 NTS-G慶大霉素藥物釋放可分為兩部分：初始突發(fā)釋放和后期緩慢釋放，初始釋放濃度為51.50 μg/mL，第6 h為73.13 μg/ml，大多數(shù)負(fù)載的慶大霉素大約在9 h內(nèi)釋放。經(jīng)過一個(gè)爆發(fā)性初始釋放后，慶大霉素從納米管釋放呈現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)期，釋放量幾乎保持不變，維持在89.10 μg/ml水平。3種鈦表面體外抗菌活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TiO2納米管抗菌覆膜假體表面死亡細(xì)菌菌落顯著增加(P<0.05)。結(jié)論 鈦表面TiO2納米管抗菌覆膜為人工關(guān)節(jié)相關(guān)感染預(yù)防提供了新途徑，骨科植入材料表面納米管抗生素覆膜具有廣泛的應(yīng)用潛力。

TiO2納米管；慶大霉素；藥物釋放動(dòng)力學(xué)；表皮葡萄球菌；抗菌活性

感染與假體松動(dòng)并列為導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)假體失敗的兩大原因[1-3]。盡管制定有嚴(yán)格的消毒程序，初次人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染率依然高達(dá)1%～4%[4,5]。細(xì)菌黏附是細(xì)菌生物膜形成前提，也是感染發(fā)生的最重要環(huán)節(jié)[6]。假體表面細(xì)菌膜一旦形成，治療非常困難，因此防止細(xì)菌在假體表面黏附是預(yù)防感染的關(guān)鍵[6,7]。鑒于抗生素全身使用存在生物利用度差、效價(jià)低、缺乏選擇性和生物毒性等缺點(diǎn)[8]?？股鼐植渴褂帽徽J(rèn)為更加安全、有效[9,10]?？股毓撬嘁言诠撬嘈图袤w置換術(shù)的感染預(yù)防和治療中被廣泛應(yīng)用[11]。非骨水泥假體尚未建立起有效的局部感染預(yù)防體系，而非骨水泥假體在臨床的應(yīng)用逐漸成為主流[12]。20世紀(jì)70年代，Buchholz等[13]提出藥物傳遞系統(tǒng)概念為其指引了方向。納米技術(shù)的研究與應(yīng)用，特別是納米結(jié)構(gòu)孔隙直徑、孔隙率的可控性以及納米表面優(yōu)良的生物學(xué)功能特性使之成為藥物載體控釋系統(tǒng)研究熱點(diǎn)[14，15]。其中，鈦金屬表面電化學(xué)陽極氧化生成的二氧化鈦納米管陣列尤為引人關(guān)注[16,17]。鈦表面二氧化鈦納米管陣列可作為一種新型納米管藥物控釋載體[5，18,19]。Popat等[19]報(bào)道負(fù)載慶大霉素納米管體外可減少細(xì)菌的黏附、提高成骨細(xì)胞功能。然而，其納米管藥物負(fù)載特性及其藥物釋放動(dòng)力學(xué)特征、抗菌活性尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究采用電化學(xué)氧化法在鈦假體表面構(gòu)建TiO2納米管藥物控釋系統(tǒng)，采用凍干法加載慶大霉素，在磷酸鹽緩沖鹽水中進(jìn)行藥物釋放動(dòng)力學(xué)，并對(duì)有負(fù)載抗生素納米管進(jìn)行體外抗菌性能評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料 99.5%純鈦片(直徑10 mm，厚度1 mm)， HNO3與HF混合液(1∶1)，電解液(0.5% NH4F和10%蒸餾水的乙二醇)，丙酮，去離子水，慶大霉素(Sigma-Aldrich公司，美國)，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS; Sigma)，甘油培養(yǎng)液，LB培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich公司)，表皮葡萄球菌(ATCC35984)(上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌株)；掃描電子顯微鏡(S-3400，日立)冷凍干燥系統(tǒng)(LABCONCO-7753072)，12孔板(美國)，紫外線分光光度計(jì)(德國)。

1.2 TiO2納米管抗菌覆膜藥物釋放動(dòng)力學(xué)表征

1.2.1 鈦假體表面TiO2納米管制備和藥物負(fù)載 99.5%純鈦片電化學(xué)陽極化處理之前先行超聲處理，用丙酮除去表面油污。然后放入HNO3和HF混合液(1∶1)中化學(xué)拋光60 s，離子水清洗后放入電解液中進(jìn)行電化學(xué)氧化處理。按照林文濤等[20]報(bào)道方法在金屬鈦片表面生成長(zhǎng)度200 nm、直徑80 nm鈦納米管樣覆層(NTS)，電子顯微鏡掃描觀察。去離子水清洗、干燥后備用。進(jìn)行抗菌和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前使用紫外線照射消毒。

慶大霉素采用冷凍真空干燥法加載[19]。慶大霉素加入PBS中配制成濃度為100 mg/L溶液。抽取溶液25 μl沒過NTS表面，輕輕震蕩以確保藥液均勻覆蓋，后置入冷凍干燥系統(tǒng)中，在-45 ℃真空下冷凍、干燥2 h。重復(fù)上述加載步驟，直到鈦納米管負(fù)載慶大霉素量至2 mg，形成負(fù)載慶大霉素納米管抗菌覆膜(NTS-G)。最后一次干燥步驟完成后，用1 ml PBS迅速漂洗去除鈦片表面過量藥物備用。

1.2.2 納米抗菌覆膜藥物釋放動(dòng)力學(xué)測(cè)定 NTS-G藥物釋放動(dòng)力學(xué)選擇標(biāo)準(zhǔn)方法表征[19]。簡(jiǎn)言之，在盛有500 μl PBS的 12孔板中各自浸入1片NTS-G，置于室溫下、轉(zhuǎn)速為70的軌道上勻速震蕩，在規(guī)定時(shí)間間隔內(nèi)依次抽送200 μl樣品進(jìn)行藥物釋放量測(cè)定。每次抽送后即刻加入等量PBS恢復(fù)到500 μl。抽取溶液濃度采用紫外線分光光度計(jì)分析，標(biāo)定值設(shè)為332 nm。記錄各時(shí)間段溶液中慶大霉素釋放濃度值，創(chuàng)建NTS-G的標(biāo)準(zhǔn)濃度釋放曲線。PBS中慶大霉素濃度即可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行確定。

1.3 納米管抗菌覆膜的體外抗菌作用

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 使用表皮葡萄球菌(ATCC35984)進(jìn)行抗菌能力評(píng)價(jià)。體外研究前，將培養(yǎng)基中的菌株置于37 ℃培養(yǎng)24 h，使細(xì)菌濃度增殖至107CFU(菌落單位)/ml。細(xì)菌濃度通過光學(xué)密度測(cè)量法評(píng)估。

1.3.2 細(xì)菌黏附 細(xì)菌粘附試驗(yàn)在Cp-Ti、NTS和NTS-G三種材料表面進(jìn)行，細(xì)菌孵育、增殖期間將三種鈦片用3 ml無菌PBS洗滌3次。從濃度為107CFU/ml細(xì)菌懸浮液中，各抽取1 ml和每類樣品一起加載至LB培養(yǎng)基，在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)6 h。觀察培養(yǎng)基細(xì)菌生長(zhǎng)情況(圖1)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。假定慶大霉素涂層可將感染率降低50%，體外實(shí)驗(yàn)被可視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 NTS和NTS-G電鏡掃描形態(tài)特征 圖2A、B表示直徑為80納米的NTS的SEM圖像。圖2C顯示NTS-G表面SEM圖像。碳納米管表面加載慶大霉素后保持了納米管狀結(jié)構(gòu)。

圖1 納米管抗菌覆膜的體外抗菌試驗(yàn)培養(yǎng)基細(xì)菌生長(zhǎng)

圖2 NTS與NTS-G電子顯微鏡觀察

2.2 藥物負(fù)載和釋放 圖3顯示NTS-G的慶大霉素藥物釋放數(shù)據(jù)示意圖。NTS-G中藥物釋放可分為兩部分：初始突發(fā)釋放和后期緩慢釋放。體外NTS-G慶大霉素初始釋放濃度為51.50 μg，第6 h釋放慶大霉素量為73.13 μg/ml，大多數(shù)負(fù)載的慶大霉素大約在9 h內(nèi)釋放。經(jīng)過一個(gè)爆發(fā)性初始釋放后，慶大霉素從納米管釋放呈現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)期，釋放量幾乎保持不變，維持在89.10 μg水平。

圖3 TiO2納米管慶大霉素覆膜藥物釋放動(dòng)力學(xué)特征

2.3 體外抗菌能力 本實(shí)驗(yàn)菌株表皮葡萄球菌389慶大霉素最小抑菌濃度(MIC=16 μg/ml)。3種不同鈦片的培養(yǎng)基細(xì)菌菌落黏附情況如圖1A-C所示，6 h培養(yǎng)后結(jié)果表明，NTS-G能夠有效降低細(xì)菌的黏附，其表面細(xì)菌黏附數(shù)量(0.05 CFUs/ml)顯著少于Cp-Ti表面(0.8 CFUs/ml)或NTS表面(0.8 CFUs/ml)，NTS-G組與在NTS和Cp-Ti相比較差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。在NTS-G的表面上或在培養(yǎng)液中沒有觀察到活的細(xì)菌生長(zhǎng)。在另外兩個(gè)Cp-Ti和NTS表面及細(xì)菌培養(yǎng)基上，可以觀察到活細(xì)菌生長(zhǎng)。但NTS表面細(xì)菌黏附數(shù)量少于Cp-Ti表面的細(xì)菌黏附數(shù)量，在降低感染率方面NTS優(yōu)于Cp-Ti，NTS和Cp-Ti組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

相對(duì)于全身給藥，局部抗生素使用在置入物相關(guān)感染預(yù)防中具有更多優(yōu)勢(shì)。細(xì)菌黏附是細(xì)菌生物膜形成的前提，也是感染發(fā)生的一個(gè)最重要環(huán)節(jié)[6]。研究表明，假體置入后的6 h是一個(gè)“決定性時(shí)期”，也是感染預(yù)防獲得長(zhǎng)期成功的關(guān)鍵[4，21]。相對(duì)于骨水泥假體較為成熟的抗生素骨水泥感染局部預(yù)防策略，非骨水泥假體尚未建立起有效的局部感染預(yù)防體系。人工關(guān)節(jié)假體表面抗生素負(fù)載，特別是鈦納米管藥物緩釋系統(tǒng)研究，為其提供了可行性方向。

Popat等[19]發(fā)現(xiàn)，直徑為80 nm納米管藥物負(fù)載量更大，且能獲得較低和持久藥物釋放。Wen等[20]比較研究80、120、160、200 nm等直徑NTS-G最大藥物負(fù)載和藥物釋放動(dòng)力學(xué)特征，顯示所有直徑NTS-G初始都呈現(xiàn)爆發(fā)性釋放，慶大霉素初始釋放濃度都能有效殺滅手術(shù)過程黏附至假體表面的細(xì)菌。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)NTS具有抑制細(xì)菌黏附作用，直徑為80 nm的納米管表面顯現(xiàn)出更強(qiáng)大的抑制細(xì)菌黏附和生物膜形成特性[20，23]。藥物載體材料組織相容性和合適的藥物釋放系統(tǒng)模型，以及其在體內(nèi)骨組織藥物療效，被確認(rèn)是局部藥物釋放系統(tǒng)研究必須首先解決的關(guān)鍵問題[24,25]。鈦是人工關(guān)節(jié)假體常用制備材料，且研究表明納米化處理鈦表面骨整合能力明顯增加[6，26]。因此，筆者選擇直徑為80 nm納米管作為NTS-G藥物負(fù)載和藥物釋放動(dòng)力學(xué)研究的載體。

選擇慶大霉素被選為加載藥物有如下幾個(gè)原因：(1)它可有效對(duì)抗大人工置換術(shù)后感染常見類型的細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌[27]；(2)慶大霉素價(jià)值低廉[28]。為了延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間，我們制造TNTS具有較大直徑和表面，且將慶大霉素負(fù)載提升到2 mg水平。

假體置入后6 h是防止細(xì)菌黏附、到置換長(zhǎng)期成功的至關(guān)重要的“決定性時(shí)期”[4，21]。本研究NTS-G慶大霉素藥物釋放數(shù)據(jù)顯示，NTS-G表面藥物釋放特征與其他報(bào)告類似[20]，可分為初始突發(fā)釋放和后期緩慢釋放兩部分。體外慶大霉素從NTS-G初始釋放濃度為51.50 μg，NTS-G初始突發(fā)釋放的慶大霉素初始濃度足以有效殺死在手術(shù)過程中黏附于假體表面的細(xì)菌。第6小時(shí)釋放慶大霉素量為73.13 μg/ml，大大超出表皮黃色葡萄球菌的MIC，且NTS-G負(fù)載慶大霉素的大多數(shù)大約在9 h內(nèi)釋放，可以明顯增強(qiáng)局部的初始抗菌效應(yīng)。同時(shí)，經(jīng)過一個(gè)爆發(fā)性初始釋放后，慶大霉素從納米管釋放呈現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)期，釋放量幾乎保持不變，在90 h時(shí)其釋放濃度依然可達(dá)89.10 μg/ml。表明藥物從NTS-G表面快速釋放模式對(duì)于抑制細(xì)菌的入侵和防止植入?yún)^(qū)域的早期污染可以取到重要預(yù)防作用。

然而，體外藥物釋放模式難以簡(jiǎn)明地反映體內(nèi)藥物釋放動(dòng)力學(xué)特征。假體置入股骨髓腔后，其表面主要為血液或血腫所包圍(如全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中的股骨假體)的一個(gè)封閉的環(huán)境中。血腫，血液在血管外局部以液體形式聚集，難以迅速更新。因此，藥物釋放動(dòng)力學(xué)，主要取決于周圍血腫動(dòng)態(tài)變化。

本研究檢測(cè)3種不同鈦片細(xì)菌菌落黏附情況，結(jié)果表明NTS-G能夠有效降低細(xì)菌的黏附，其表面細(xì)菌黏附數(shù)量顯著少于Cp-Ti或NTS表面，NTS-G組與在NTS和Cp-Ti相比比較有顯著的統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)。在NTS-G的表面上或在培養(yǎng)液中沒有觀察到活的細(xì)菌生長(zhǎng)。在另外兩個(gè)Cp-Ti和NTS表面及細(xì)菌培養(yǎng)基上，可以觀察到活細(xì)菌生長(zhǎng)，但NTS表面細(xì)菌黏附少于前者。體外研究表明，NTS-G可以顯著抑制細(xì)菌的黏附和生物膜的形成，而無慶大霉素負(fù)載的納米管也出現(xiàn)溫和的抗菌能力。

NTS制備、慶大霉素藥物負(fù)載、釋放動(dòng)力學(xué)和NTS-G體外抑菌試驗(yàn)表明，NTS可以作為非骨水泥人工關(guān)節(jié)假體表面局部感染預(yù)防的抗生素藥物緩釋載體，基于TiO2納米管建立局部抗生素負(fù)載載體進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置入物相關(guān)感染的預(yù)防是一個(gè)很有吸引力的戰(zhàn)略選擇。

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(2015-04-22收稿 2015-06-07修回)

(責(zé)任編輯 張 楠)

Drug-release kinetics characterization of gentamicin from TiO2nanotubes and its antibacterial activityinvitro

FENG Mingguang1,LIU Zhongtang2, WANG Liqiang3, XU Li1, YANG Haitao1, WANG Jian1, WANG Haiyang1,and QING Shixin1.

1.Department of Orthopedics, Shanghai Municipal Corps Hospital Chinese People’s Armed Police Force, Shanghai 201103, China；2.Department of Orthopedics, the Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233,China;3.College of Materials Science and Engineering, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China

Objective To determine the release kinetics of gentamicin from the TiO2nanotubes(TNS-G), and to detect its antibacterial activityinvitro. Methods TiO2nanotubes (NTS) were fabricated on the titanium surface by electrochemical anodization. These nanotubes were loaded with gentamicin using a lyophilization method and vacuum drying, and its pharmacokinetics was detected in phosphate buffer.Staphylococcusaureuswas used to study the antibacterial properties of the NTS-G. There were three study groups: the commercially pure titanium(Cp-Ti)group, the NTS group, and the NTS-G group.We compared the antibacterial efficacy with each other by bacterial adhesion and colony counting in bacterial culture. Results Drug release of NTS-G could be divided into two parts: initial burst release and relatively slow release.The fast initial concentration was 51.50 μg/ml , and 73.13 μg/ml at the 6 th hours. Most of load gentamicin was released within approximately 9 hours.In the second phase, different drug release kinetics were observed, with very slow and linearly increasing cumulative release over a period of 90 h. The drug concentration was maintained at about 89.10 μg/ml. We found that NTS-G could significantly inhibit bacterial adhesion and bioflm formation, compared with Cp-Ti or NTS, (P<0.05). Conclusions Titanium dioxide nanotubes loaded with antibiotics can deliver a high concentration of antibiotics locally at a specifc site, thereby providing a new strategy to prevent implant-associated infections.

TiO2nanotubes; gentamicin; Drug-release kinetics;Staphylococcusepidermidis; antibacterial activity

國家自然科學(xué)基金(81171738);上海市衛(wèi)生局(2011201)

馮明光，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail：mingguang-feng@126

1.201103，武警上?？傟?duì)醫(yī)院骨科；2.200233，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院；3.200240，上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院

劉忠堂,E-mail：surgeon_liu@163.com

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