趙彥功，舒清明，程 芮，白 皛，羅 敏，段媛媛

論 著

閉合性顱腦損傷大鼠血清和海馬SAX2蛋白質譜的表達

趙彥功1，舒清明2，程 芮1，白 皛1，羅 敏1，段媛媛1

目的 研究閉合性顱腦損傷大鼠血清和海馬SAX2蛋白質表達譜，探尋腦損傷生物標志蛋白。方法 選72只雄性SD大鼠隨機分為手術對照組及損傷后4、8、12、24、48 h組，復制Marmarou落體打擊大鼠腦損傷模型，分別進行常規(guī)HE染色、尼氏染色；并用強陰離子交換芯片(SAX2)質譜技術分析大鼠閉合性腦損傷后不同時間血清和海馬中蛋白質表達譜的改變。結果 (1)SAX2芯片共獲得530個血清蛋白質峰，147個海馬蛋白質峰，6個組中，SAX2芯片在血清和海馬中都能捕獲的蛋白質數(shù)是14個。(2)血清中檢測到的差異蛋白質，損傷后共有45個蛋白質峰的相對強度與手術對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；另有97個蛋白質峰在對照組中未檢測到。(3)海馬中檢測到的差異蛋白質，損傷后共有18個蛋白質峰的相對強度與手術對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；另有40個蛋白質峰在對照組中未檢測到。(4)在SAX2芯片上，血清和海馬中均能檢測到3656Da這一蛋白質，該蛋白質在血清中于損傷后4 h可以檢測到，在海馬中于損傷后12 h可檢測到。結論 腦損傷可引起血清和海馬SAX2蛋白質表達譜變化；血清和海馬SAX2蛋白質表達譜存在差異，提示血清中出現(xiàn)的部分蛋白質可能為腦損傷誘導的血細胞基因表達產物；在血清和海馬中檢測到的差異蛋白質以及損傷后新出現(xiàn)的蛋白質峰，可能是腦損傷生物標志蛋白。

腦損傷；大鼠；SAX2蛋白質芯片；血清；海馬

創(chuàng)傷對人類造成的威脅日趨嚴峻，已成為死亡的主要原因之一，尤其是創(chuàng)傷性腦損傷已成為傷病致死的重要病因。目前，有學者采用cDNA芯片技術研究外傷性腦損傷后基因表達在蛋白質譜的改變，實驗結果表明外傷性腦損傷可引起不同部位的不同基因質譜表達的改變[1-4]。本實驗采用SAX2蛋白質芯片研究腦損傷后腦組織和血液中蛋白質表達譜的差異，探尋腦損傷生物標志蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 SAX2蛋白質芯片、PBSⅡ-C型蛋白質芯片閱讀機、生物芯片處理器(美國Ciphergen公司)。

1.1.2 主要試劑 SAX2芯片緩沖液(0.05%Triton x-100 in 50 Mm Tris-Hcl)。

1.2 方法

1.2.1 建立腦損傷模型 雄性SD大鼠72只(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)，體重350～450 g, 其中用于蛋白質芯片研究48只，常規(guī)病理學研究24只。采用成組設計隨機分為手術對照組和損傷后4、8、12、24、48 h組，用于蛋白質芯片研究每組8只，病理學研究每組4只。打擊前24 h在2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)腹腔麻醉下切開頭頂部皮膚，將不銹鋼打擊墊片固定在大鼠的顱骨穹隆部。打擊時將大鼠置于厚海綿床上，以使大鼠頭部能在打擊后沿外力作用向前運動并避免顱腦局限性損傷。創(chuàng)傷的程度由改變墜落物的高度來調節(jié)。采用的落體重量450 g，高度1.5 m，復制Marmarou落體打擊腦損傷模型[1]。手術對照組動物僅切開頭頂部皮膚，將不銹鋼打擊墊片固定在大鼠的顱骨穹隆部，于術后24 h處死，取材及后處理同損傷組。

1.2.2 病理檢查 對照組于埋置墊片后24 h，損傷組于打擊后不同時間點，于海馬齒狀回互包平面行冠狀切面，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚5 μm，分別進行常規(guī)HE染色、尼氏染色。

1.2.3 蛋白質芯片檢測

1.2.3.1 采血 手術對照組動物于埋置墊片后24 h，損傷組動物于打擊后不同時間點在2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg體重)腹腔麻醉下開胸，左心室取血4 ml，冰上靜置1 h后，5000 r/min離心10 min(0 ℃)；分離血清并以每份40 μl分裝，-80 ℃凍存。樣品前處理：融解冰凍血清，13 000 r/min離心10 min(4 ℃)；取20 μl血清，加入60 μl U9緩沖液，充分混勻，使蛋白變性，制成80 μl血清樣品待用。

1.2.3.2 海馬取材 手術對照組動物于埋置墊片后24 h，損傷組動物于打擊后不同時間點在2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg體重)腹腔麻醉下斷頭處死，立即取雙側海馬置-80 ℃保存。樣品前處理：融解冰凍組織，每只大鼠取100 mg海馬，放入勻漿器中加1 ml U9緩沖液和少量PMSF在冰上將組織勻漿，13 000 r/min離心10 min(4 ℃)；取上清750 μl置于2 ml專用離心管，40 000 r/min離心2 h(15 ℃)；分離上清液并以50 μl分裝，凍存于-80 ℃。

1.2.3.3 血清樣本SAX2蛋白芯片檢測 將芯片裝入生物芯片處理器，加100 μl 結合緩沖液，室溫振蕩孵育5 min，共3次。從上述80 μl蛋白變性后的血清樣品中取40 μl樣品，加入360 μl結合緩沖液混勻，取100 μl點樣，于4 ℃振蕩孵育1 h后除去樣品。用150 μl洗脫緩沖液洗滌芯片2次，每次5 min，HPLC水沖洗1次，自然晾干芯片，加0.5 μl SPA 2次，表面干后，用蛋白質芯片閱讀機進行蛋白質譜分析。

1.2.3.4 海馬樣本 SAX2蛋白芯片檢測：將芯片裝入生物芯片處理器，加200 μl 結合緩沖液，室溫振蕩孵育5 min，共2次。根據(jù)所測的樣品蛋白質濃度用結合緩沖液稀釋至0.8 mg/ml，取100μl點樣，于4 ℃振蕩孵育1 h后除去樣品。用200 μl洗脫緩沖液洗滌芯片2次，每次5 min，HPLC水沖洗1次，自然晾干芯片，加0.5 μl SPA 2次，表面干后，用蛋白質芯片閱讀機進行蛋白質譜分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 蛋白質芯片檢測結果采用Ciphergen proteinchip 3.0軟件(美國Ciphergen公司)采集數(shù)據(jù)，用Biomarker Wizard分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，手術對照組與腦損傷后不同時間組之間蛋白質峰相對強度比較采用t檢驗，確定兩組之間P<0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般表現(xiàn) 損傷組動物于打擊后有42只大鼠(70%)出現(xiàn)抽搐并伴有呼吸暫停，持續(xù)約15 s；在沒有出現(xiàn)抽搐的大鼠中有6只大鼠(10%)出現(xiàn)驚厥，持續(xù)約30 s；2只大鼠(3%)于打擊后出現(xiàn)持續(xù)呼吸抑制和全身抽搐，幾十秒鐘后呼吸停止，死亡。10只大鼠(17%)傷后有肢體活動受限，表現(xiàn)為單肢或單側肢體活動受限。

2.2 病理改變

2.2.1 大體改變 損傷組大鼠可見蛛網(wǎng)膜下腔出血，主要分布在腦底、小腦和腦干，無明顯大面積挫傷或局灶性挫裂傷；切面可見胼胝體點狀出血及雙側腦室出血。

2.2.2 組織學改變

2.2.2.1 常規(guī)HE染色 損傷組大鼠HE染色主要表現(xiàn)為額葉、頂葉、枕葉、小腦及腦干蛛網(wǎng)膜下腔出血，側腦室出血，小挫傷灶。部分神經細胞胞體濃縮，胞核固縮，胞漿內尼氏小體消失呈同質性嗜酸性著色(紅色神經細胞)；部分神經細胞胞體腫脹，胞質不規(guī)則淡染，核腫大淡染或消失。腦組織水腫，表現(xiàn)為腦組織疏松、神經細胞及血管周圍間隙增大,腦干部分神經纖維增粗、呈波浪狀改變。各損傷組海馬區(qū)可見不同程度損傷，損傷后8 h達到高峰。

2.2.2.2 甲苯胺藍尼氏染色 HE染色中所見的紅色神經細胞，甲苯胺藍染色呈深藍色；HE染色胞體腫脹，尼氏小體減少或消失的細胞，甲苯胺藍染色整個細胞呈淡藍色。陽性細胞常呈灶狀分布，與HE染色中紅色神經細胞的分布基本一致。

2.3 蛋白質表達譜改變

2.3.1 蛋白質在不同芯片上的分布 采用PBSⅡ-C型蛋白質芯片閱讀機，自動收集蛋白質峰，對位于2000～20 000的質荷比峰值,用Biomarker Wizard濾噪，設置初始濾噪值為5，第2次濾噪值為2，以0%為最小閾值進行聚類。所有原始數(shù)據(jù)先用Ciphergen proteinchip 3.0軟件做校正(總離子強度及分子量均一化)。每個樣品至少采用兩個以上同類芯片檢測，經分析表明平行蛋白質芯片之間的平均變異系數(shù)小于25%。除去基質峰，SAX2芯片共獲得716個血清蛋白質峰；207個海馬蛋白質峰(表 1)。SAX2芯片在血清和海馬中都能捕獲的蛋白質數(shù)是14個。

表1 閉合性顱腦損傷大鼠各組在血清和海馬中檢測到的蛋白質峰總數(shù)

注：括號中的數(shù)據(jù)包括與對照組相比有統(tǒng)計學意義的峰數(shù)和對照組沒有檢測到的峰數(shù)。

2.3.2 不同樣本中檢測到的差異蛋白質

2.3.2.1 血清中檢測到的差異蛋白質 在SAX2芯片上，損傷后共有60個蛋白質峰的相對強度與手術對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；另有109個蛋白質峰在對照組未檢測到(表2)。

2.3.2.2 海馬中檢測到的差異蛋白質 在SAX2芯片上，損傷后共有24個蛋白質峰的相對強度與手術對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；另有49個蛋白質峰在對照組未檢測到(表2)。

表2 閉合性顱腦損傷大鼠各組中血清及海馬檢測到差異性蛋白質峰數(shù)

注：括號中的數(shù)據(jù)是閉合性顱腦損傷大鼠各組中血清及海馬在手術對照組未檢測到蛋白質峰數(shù)。

2.3.2.3 血清和海馬中均能檢測到的差異蛋白質 在SAX2芯片上，血清中有24個蛋白質峰在兩個以上時間點都可以檢測到，海馬中有3個蛋白質峰在兩個以上的時間點都可以檢測到，血清中蛋白質3656 Da于損傷后4 h可以檢測到，而在海馬中于損傷后12 h可檢測到(圖1，2)。

圖1 大鼠血清在不同損傷組中檢測到的3656 Da蛋白表達圖譜

圖2 大鼠海馬在不同損傷組中檢測到的3656 Da蛋白表達圖譜

3 討 論

臨床影像學是顱腦損傷的主要診斷方法，但微小 (<0.2 cm2)腦挫裂傷、腦震蕩等閉合性顱腦損傷尚不能用CT和MRI等方法檢測出來。為探討腦損傷與血細胞基因表達的關系，目前有很多學者通過復制大鼠腦缺血、缺氧、出血、癲癎和低血糖模型，采用基因芯片(含8740個基因)技術檢測不同動物模型24 h后血液單核細胞和全血細胞的基因表達譜，結果發(fā)現(xiàn)無論樣本來自腦組織、白細胞還是全血，每種損傷都有獨特的基因表達譜，提出腦損傷可誘導外周血細胞基因表達發(fā)生改變[2-6]。因此，通過檢測外周血中蛋白質濃度尋找顱腦損傷的特異性標志物來反映腦損害的嚴重程度，具有一定的實際應用價值。

自由落體顱腦損傷模型可以復制臨床上閉合性加速性顱腦損傷。這其中以Marmarou模型應用較為廣泛[1]。本實驗為研究腦損傷后蛋白質表達譜的改變，復制了Marmarou大鼠腦損傷模型。實驗結果顯示，損傷組動物中打擊后出現(xiàn)抽搐并伴有呼吸暫停、驚厥、肢體活動受限，表現(xiàn)為單肢或單側肢體活動受限。大體病理學改變主要表現(xiàn)為蛛網(wǎng)膜下腔出血，多累及腦底和腦干等部位。HE染色主要表現(xiàn)為額、頂、枕葉、小腦及腦干蛛網(wǎng)膜下腔出血，側腦室出血，小挫傷灶，神經元變性壞死、水腫，以傷后8 h為重。甲苯胺藍染色顯示損傷后尼氏小體減少或消失。結果表明，腦損傷動物模型復制成功。鑒于海馬對CNS的損傷最為敏感，作為前期探索性研究，筆者選取海馬作為觀察對象。

本實驗選擇了SAX2蛋白質芯片對大鼠腦損傷后4～48 h血清和海馬蛋白質表達譜進行研究。SAX2芯片為強陰離子交換芯片，用于分析負電荷蛋白，陽離子和季胺集團構成活性位點，與樣品中精氨酸、谷氨酸反應，選擇性分析低等電點的蛋白質。在血清中，SAX2芯片共檢測到530個蛋白質峰，在海馬中，SAX2芯片共檢測到147個蛋白質峰。在不同樣本中檢測到的差異蛋白質，與對照組相比，損傷組檢測到的蛋白質峰相對強度有統(tǒng)計學意義的峰數(shù)中，血清多于海馬。在所有的差異蛋白質中，在血清中有24個可以在兩個或以上的時間點檢測到，在海馬中有3個可以在兩個或以上的時間點檢測到。腦損傷后蛋白質表達譜在血清中顯示以上調為主，在海馬中顯示以下調為主，血清和腦組織中蛋白質表達譜存在差異。SAX2芯片在血清和海馬中都能捕獲的蛋白質數(shù)是1個，為3656 Da，于損傷后4 h在血清中先檢測到，而在海馬中于損傷后12 h才檢測到。

從上述結果可以推斷，在腦損傷發(fā)生和發(fā)展過程中，其細胞內的蛋白質變化在血清中可有改變；損傷后部分蛋白質在海馬中出現(xiàn)先于血清中，還有部分蛋白質在損傷后血清中出現(xiàn)先于海馬，可能是血腦屏障破壞、通透性增加、炎性反應、免疫反應和氧化反應等共同作用的結果。當然，并非所有腦損傷細胞內發(fā)生改變的蛋白質都可在血清中被檢測出來。有些改變的蛋白質可能只存在于細胞內而不分泌或漏出到細胞外，這部分蛋白質可能是與腦損傷發(fā)生密切相關的功能蛋白和調節(jié)蛋白。大鼠腦損傷后無論是血清中還是海馬中都能檢測到上調和下調的蛋白質，上調的蛋白質中既可能有參與原發(fā)性損傷的，又可能有參與繼發(fā)性損傷的，也可能有參與修復的。下調的蛋白質可能是損傷抑制的結果。

總之，腦損傷可引起血清和海馬蛋白質表達譜變化。血清和海馬蛋白質表達譜存在差異，提示血清中出現(xiàn)的部分蛋白質可能為腦損傷誘導的血細胞基因表達產物。在血清和海馬中檢測到的差異蛋白質，以及損傷后新出現(xiàn)的蛋白質峰，可能是腦損傷生物標志蛋白，可用于腦損傷的診斷和治療。

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(2015-07-01收稿 2015-08-20修回)

(責任編輯 岳建華)

Alteration of SAX2 protein expression pattern in rat serum and hippocampus after closed head injury

ZHAO Yangong1，SHU Qingming2，CHENG Rui1，BAI Xiao1，LUO Min1，and DUAN Yuanyuan1.

1. Department No.1 of South Building，2.Department of Pathology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039, China

Objective To study the alteration of SAX2 protein expression pattern in rat serum and hippocampus after closed head injury and to find biomarkers of brain injury. Methods Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group and injury groups which were subjected to Marmarou’s brain injury and then subdivided into 4 h、8 h、12 h、24 h and 48 h groups according to the time elapsed after injury. The pathological study included H&E staining and toluidine blue staining. The change of protein expression pattern in serum and hippocampus were monitored with strong anion exchange chips (SAX2). Results (1)A total of 530 protein peaks were detected on SAX2 chips in serum，and a total of 147 protein peaks in hippocampus. (2) Among the total of protein peaks detected, the relative intensity of 45 protein peaks was shown to be differentially altered on SAX2 chips in serum of injury groups, compared with sham operation group(P<0.05). There were 97 protein peaks in serum of injury groups, which could not be detected in sham operation group with SAX2 chips. (3) The relative intensity of 18 protein peaks was shown to be differentially altered on SAX2 chips in hippocampus of injury groups compared with sham operation group(P<0.05). There were 40 protein peaks in hippocampus of injury groups which could not be detected in sham operation group with SAX2 chips. (4) On SAX2 chips, only one protein(3656Da) peak was detected not only in serum but also in hippocampus. Conclusions The alteration of SAX2 protein expression patterns in serum and hippocampus can be induced after brain injury. The SAX2 protein expression patterns of serum and hippocampus after brain injury are different, which suggests that part of protein in serum can be a production of blood cells gene expression induced by brain injury. The distinct proteins detected in serum and hippocampus includ the proteins which are significant, compared with sham operation group and those which are not detected in sham operation group. They can be biomarkers of brain injury.

brain injury; rat; protein chip; serum; hippocampus

趙彥功，博士，副主任醫(yī)師，E-mail: zhaoyangong@126.com

100039 北京，武警總醫(yī)院：1.南樓一科，2.病理科

白 皛，E-mail: 3097895653@qq.com

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