何 帥，胡廷章

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶400016；2.重慶大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶400044）

OsLEA5蛋白對(duì)乳酸脫氫酶體外保護(hù)機(jī)制的研究

何 帥1，胡廷章2

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶400016；2.重慶大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶400044）

目的確定胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA蛋白）在體外不同壓力脅迫下對(duì)酶活性的保護(hù)作用，并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行探討。方法評(píng)估OsLEA5蛋白對(duì)于防止乳酸脫氫酶（LDH）免受高溫（43℃）、反復(fù)凍融和干燥脫水傷害的保護(hù)能力。磷酸鹽緩沖液、牛血清蛋白（BSA）和純水分別用于陽性和陰性對(duì)照。結(jié)果OsLEA5蛋白組相對(duì)活性百分比在熱處理10、20、30 min后分別是純水對(duì)照組的2.2、3.7、5.4倍。在5個(gè)反復(fù)凍融循環(huán)后，純水對(duì)照組的LDH活性降至7%甚至更低，而質(zhì)量比2∶1和5∶1的OsLEA5蛋白組分別為28%和69%，質(zhì)量比為10∶1組其活性幾乎未受到影響。經(jīng)過干燥處理后，不同質(zhì)量比組LDH活性均有明顯降低，其中純水對(duì)照組和磷酸鹽緩沖液組的LDH接近完全失活。質(zhì)量比為5∶1和10∶1的OsLEA5蛋白組相對(duì)活性分別達(dá)24%和36%。結(jié)論OsLEA5蛋白能夠在各種環(huán)境脅迫下有效保護(hù)底物酶的體外活性或防止失活。

L-乳酸脫氫酶； 植物蛋白質(zhì)類； 高溫，誘發(fā)； 反復(fù)凍融； 脫水

通常在環(huán)境壓力下，細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控體系會(huì)有變化，原有的一些正常蛋白質(zhì)合成途徑受到抑制，同時(shí)還會(huì)誘導(dǎo)出許多新蛋白的合成，植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA蛋白）就是其中之一[1]。LEA蛋白是一種小分子的特異性親水多肽，在干旱條件下細(xì)胞會(huì)積累一系列LEA蛋白來保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)和生物大分子，以減少脫水損傷，其分子作用機(jī)制豐富多樣，如束縛離子、防止蛋白聚集、穩(wěn)定酶的功能和結(jié)構(gòu)等[2]。近年來，許多研究已揭示了一些LEA蛋白能夠有效保護(hù)乳酸脫氫酶（LDH）免受冷凍的傷害，此外，還有報(bào)道該類蛋白保護(hù)檸檬酸合成酶（CS）、延胡索酸酶和蘋果酸脫氫酶等免受脫水傷害的實(shí)驗(yàn)證據(jù)[3]。但值得注意的是，同樣高度親水的其他蛋白卻不能像LEA蛋白一樣具有這些保護(hù)功能[4]。不過，目前對(duì)于LEA蛋白的確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。為了確定LEA蛋白在不同壓力條件下對(duì)酶體外活性的保護(hù)作用，作者研究了OsLEA5蛋白對(duì)于LDH在高溫、冷凍和干燥環(huán)境壓力下的活性變化情況。截至目前，所有這些因外界壓力脅迫而失活產(chǎn)生變性蛋白或聚集物的機(jī)制并不十分清楚[5]。

1 材料與方法

1.1 材料 來源于家兔肌肉的LDH和牛血清蛋白（BSA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，OsLEA5蛋白由重慶大學(xué)生命科學(xué)院胡廷章教授的實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 LDH的脅迫處理 首先用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）將LDH稀釋至終濃度為0.1 mg/mL的LDH稀溶液。磷酸鹽緩沖液（PBS）、BSA和純水分別用于陽性和陰性對(duì)照。熱脅迫處理：分別將2 μL的純水、PBS、BSA和OsLEA5蛋白加入到20 μLLDH稀溶液中，在43℃水浴鍋中孵育，分別于10、20、30 min指定時(shí)間取出2μL混合液，冰上放置5 min后進(jìn)行活性檢測(cè)。冷凍脅迫處理：將一定量的純水、PBS、BSA和OsLEA5蛋白加入到一定量的LDH稀溶液中，分別制成質(zhì)量比（保護(hù)劑為L(zhǎng)DH）為2∶1、5∶1和10∶1的混合液。將這些混合液用液氮迅速冷凍，停留1 min，然后于室溫下放置10 min。上述步驟即為1個(gè)凍融循環(huán)，每個(gè)樣本如此重復(fù)5次。干燥脅迫處理：同冷處理一樣，制成質(zhì)量比（保護(hù)劑∶LDH）為2∶1、5∶1和10∶1的混合液。將上述混合液在相對(duì)濕度為50%、溫度25℃的空氣流中干燥5 h，然后立即加純水至原體積實(shí)現(xiàn)再水合，最后在室溫下放置10 min。

1.2.2 LDH活性測(cè)量 將2μL經(jīng)脅迫處理后的樣本加入到 1 mL的活性測(cè)定緩沖液（100 mmol/L PBS、0.1 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、2 mmol/L丙酮酸鹽）中。然后在波長(zhǎng)為A340的分光光度計(jì)中檢測(cè)1 min，LDH活性即被測(cè)定。在本實(shí)驗(yàn)中，純水作為空白對(duì)照，所有數(shù)值均以已處理樣本相對(duì)于未處理樣本的相對(duì)活性百分比表示，所有樣本重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 OsLEA5蛋白對(duì)LDH在高溫條件下的失活保護(hù)研究 在43°C高溫處理30 min后，沒有保護(hù)劑的LDH組逐漸喪失活性至原來的12%，含有PBS的LDH組其活性也顯著降低。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，失活的程度越大，OsLEA5蛋白組的相對(duì)活性百分比在熱處理10、20、30 min后分別是純水對(duì)照組的2.2、3.7、5.4倍。見圖1。

圖1 OsLEA5蛋白和純水、PBS、BSA在高溫條件下保護(hù)LDH的體外活性比較

2.2 OsLEA5蛋白對(duì)LDH在反復(fù)凍融條件下的失活保護(hù)研究 在5個(gè)反復(fù)凍融循環(huán)以后，純水對(duì)照組的LDH相對(duì)活性百分比降至7%甚至更低。而質(zhì)量比2∶1和5∶1的OsLEA5蛋白組的LDH相對(duì)活性百分比分別為28%和69%，蛋白含量更高的質(zhì)量比為10∶1組，其活性幾乎未受到影響。相比之下，作為已知的有效抗凍劑BSA的保護(hù)能力比OsLEA5蛋白差一些，最高質(zhì)量比也只有65%，然而PBS組被證明基本無保護(hù)作用。OsLEA5蛋白對(duì)LDH的保護(hù)能力從質(zhì)量比2∶1～10∶1的范圍內(nèi)，隨著濃度的增大而不斷增強(qiáng)。見圖2。

2.3 OsLEA5蛋白對(duì)LDH在干燥脫水條件下的失活保護(hù)研究 經(jīng)過劇烈干燥再水合后，不同質(zhì)量比組LDH活性均有明顯降低，其中純水對(duì)照組和PBS組的LDH接近完全失活。形成強(qiáng)烈對(duì)比的質(zhì)量比5∶1和10∶1的OsLEA5蛋白的LDH相對(duì)活性百分比分別達(dá)24%和36%。見圖3。

圖2 OsLEA5蛋白和純水、PBS、BSA在反復(fù)凍融條件下保護(hù)LDH的體外活性比較

圖3 OsLEA5蛋白和純水、PBS、BSA在干燥失活條件下保護(hù)LDH的體外活性比較

3 討 論

水分缺失是阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵性因素，所以各種有關(guān)細(xì)胞代謝變化的基因被誘導(dǎo)出來以應(yīng)對(duì)外界壓力，其中就包括了LEA蛋白的出現(xiàn)。近年來，有關(guān)LEA蛋白的體外功能機(jī)制研究一直是一個(gè)熱點(diǎn)，很多研究已證明LEA蛋白與細(xì)胞抵抗各種非生物脅迫之間聯(lián)系緊密[6-7]。在本研究中，OsLEA5蛋白作為非典型的第5組LEA蛋白，是自然折疊的、疏水的，這與常規(guī)LEA蛋白的典型特征恰好相反，揭示了該組LEA蛋白在作用機(jī)制和理化功能上有不同于傳統(tǒng)親水LEA蛋白的特點(diǎn)。

多年來，該領(lǐng)域面臨的最大問題是：到底LEA蛋白是全面多能、功能強(qiáng)大還是捉摸不透、難以揣測(cè)。有學(xué)者普遍認(rèn)為，LEA蛋白保護(hù)細(xì)胞免受脫水傷害，可能是充當(dāng)多功能的水結(jié)合分子、分子屏障、膜穩(wěn)定劑和空間填充劑及分子伴侶，以防止細(xì)胞塌陷[3]。之所以會(huì)如此多才多藝，推測(cè)是由于其天然的無序結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)上的靈活和柔韌使得LEA蛋白很容易通過空間構(gòu)象變化與目的蛋白結(jié)合，從而起到保護(hù)作用[8]。雖然這些是常規(guī)LEA蛋白所具備的，但OsLEA5蛋白這類非典型LEA蛋白也有其優(yōu)勢(shì)。一方面，盡管OsLEA5蛋白不是無序的不穩(wěn)定構(gòu)象，但相對(duì)于其他非LEA蛋白，仍然有比較理想的結(jié)構(gòu)可塑性和柔軟性，其在水相中能以更低的水活度變得更加折疊或附著在膜表面[9]；另一方面，這類LEA蛋白可能存在某種分子伴侶機(jī)制，很容易用OsLEA5蛋白的疏水性來解釋，因?yàn)槭杷鞍讜?huì)促進(jìn)聚集物暴露于表面通過暫時(shí)的疏水相互作用[10]。根據(jù)傳統(tǒng)分子伴侶理論，OsLEA5蛋白可以解開在壓力條件下相互聚集的大分子，從而提高其他正在折疊的分子伴侶或酶活性。

干燥處理可以導(dǎo)致細(xì)胞缺水，這對(duì)細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器、細(xì)胞膜和酶都是有害的。在本研究中作者發(fā)現(xiàn)，OsLEA5蛋白能夠在脫水脅迫下有效維持LDH的活性。因此，其疏水蛋白可能作為高滲保護(hù)分子在缺水壓力下發(fā)揮著比親水蛋白更有力的功能。另外，這些LEA蛋白可能通過聚集成更大分子保護(hù)酶分子的完整性并幫助脅迫之后的復(fù)原[11]。總之，作者認(rèn)為，OsLEA5蛋白可以通過穩(wěn)定分子構(gòu)象和滯留水分子而緩解由脫水帶來的傷害。

反復(fù)凍融所帶來的影響也是多方面的，包括脫水、結(jié)晶、高滲和過氧化[12]。實(shí)際上，即使沒有甘油等抗凍劑的保護(hù)，僅冰凍1次的酶活性不會(huì)受到影響，但是對(duì)反復(fù)凍融卻很敏感。酶的活性減弱程度取決于反復(fù)凍融的重復(fù)次數(shù)，而不是每次冰凍持續(xù)的時(shí)間[13]。因此，在該研究中選擇了反復(fù)凍融法來驗(yàn)證OsLEA5蛋白對(duì)LDH的抗冰凍保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsLEA5蛋白能有效防止LDH在反復(fù)凍融傷害中的失活。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)面臨低溫時(shí)，很多都會(huì)變性失活，此時(shí)OsLEA5蛋白發(fā)揮保護(hù)功能可能是由于它能夠使蛋白質(zhì)維持高級(jí)結(jié)構(gòu)和天然折疊。也有學(xué)者認(rèn)為，LEA蛋白在受到低溫脅迫時(shí)可以防止酶分子的晶體化，并且作為“分子屏障”在相鄰酶分子間形成物理屏障，從而阻止其聚集[14]。所以，有理由推斷OsLEA5蛋白與熱休克蛋白類似，能夠保護(hù)蛋白質(zhì)免受極端溫度帶來的傷害。

綜上所述，OsLEA5蛋白在回應(yīng)高溫、冷凍和干燥的非生物脅迫時(shí)展現(xiàn)了多重保護(hù)能力。需要強(qiáng)調(diào)的是，OsLEA5蛋白具有功能多樣性，這種多樣性可能是由于自由無序和疏水性，使其面對(duì)各種復(fù)雜的環(huán)境因素時(shí)更加有利。但是需要有進(jìn)一步的深入研究來徹底判斷LEA蛋白的準(zhǔn)確功能和真實(shí)身份。作者希望本研究能夠?yàn)閷磉M(jìn)一步全面闡明LEA蛋白的分子作用機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。

[1]Shao HB，Liang ZS，Shao MA.LEA proteins in higher plants：structure，function，gene expression and regulation[J].Colloids SurfB Biointerfaces，2005，45（3/4）：131-135.

[2]Dure L，Greenway SC，Galau GA.Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination：changing messenger ribonucleic acid populations as shown by in vitro and in vivo protein synthesis[J].Biochemistry，1981，20（14）：4162-4168.

[3]Tunnacliffe A，Wise MJ.The continuing conundrum of the LEA proteins[J]. Naturwissenschaften，2007，94（10）：791-812.

[4]Bahrndorff S，Tunnacliffe A，Wise MJ，et al.Bioinformatics and protein expression analyses implicate LEA proteins in the drought response of Collembola[J].J Insect Physiol，2009，55（3）：210-217.

[5]Menze MA，Hand SC.How do animal mitochondria tolerate water stress[J]. Commun Integr Biol，2009，2（5）：428-430.

[6]Apel K，Hirt H.Reactive oxygen species：metabolism，oxidative stress，and signal transduction[J].Annu Rev Plant Biol，2004，55：373-399.

[7]Mowla SB，Cuypers A，Driscoll SP，et al.Yeast complementation reveals a role for an Arabidopsis thaliana late embryogenesis abundant（LEA）-like protein in oxidative stress tolerance[J].Plant J，2006，48（3）：743-756.

[8]Fuxreiter M，Simon I，F(xiàn)riedrich P，et al.Preformed structural elements feature in partner recognition by intrinsically unstructured proteins[J]. J Mol Biol，2004，338（5）：1015-1026.

[9]Nakayama K，Okawa K，Kakizaki T，et al.Arabidopsis Cor15am is a chloroplast stromal protein that has cryoprotective activity and forms oligomers[J]. Plant Physiol，2007，144（1）：513-523.

[10]Boucher V，Buitink J，Lin X，et al.MtPM25 is an atypical hydrophobic late embryogenesis-abundant protein that dissociates cold and desiccationaggregated proteins[J].Plant Cell Environ，2010，33（3）：418-430.

[11]Chourey K，Ramani S，Apte SK.Accumulation of LEA proteins in salt（NaCl）stressed young seedlings of rice（Oryza sativa L）cultivar Bura Rata and their degradation during recovery from salinity stress[J].J Plant Physiol，2003，160（10）：1165-1174.

[12]Dalal M，Tayal D，Chinnusamy V，et al.Abiotic stress and ABA-inducible Group 4 LEA from Brassica napus plays a key role in salt and drought tolerance[J].J Biotechnol，2009，139（2）：137-145.

[13]Sleight SC，Wigginton NS，Lenski RE.Increased susceptibility to repeated freeze-thaw cycles in Escherichia coli following long-term evolution in a benign environment[J].BMC Evol Biol，2006，6：104.

[14]Kyte J，Dolittle RF.A simplemethod for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol，1982，157（1）：105-132.

A study of protection mechanism of OsLEA5 proteins on lactic dehydrogenase（LDH）in vitro

He Shuai，Hu Tingzhang
（Academy of Bioscience，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Academy of Bioscience，Chongqing University，Chongqing 400044，China）

ObjectiveTo determine the protective effect of late embryogenesis abundant（LEA）protein on enzyme activity under different stresses in vitro and discuss its potential mechanism.MethodsThe protective capability of OsLEA5 proteins to prevent lactic dehydrogenase（LDH）from high temperature（43℃），multigelation and dehydration was tested.Phosphate buffer，BSA and pure water were respectively used as positive and negative controls.ResultsThe percentage of OsLEA5 proteins′relative activity was 2.2，3.7，5.4 times higher than pure water′s after 10，20，30 min of heat treatment.Pure water′s LDH activity dropped to 7%or even lower after 5 multigelation cycles while OsLEA5 proteins with a mass ratio of 2∶1 and 5∶1 were 28% and 69%，and OsLEA5 protein with a mass ratio of 10∶1 remained uninfluenced.The LDH activity of different mass ratios clearly dropped after drying treatment，in which pure water and phosphate buffer′s LDH was almost completely inactivated，and OsLEA5 proteins with a mass ratio of 5∶1 and 10∶1 was 24%and 36%.ConclusionOsLEA5 proteins effectively protect substrate enzyme′s activity in vitro and prevent inactivation under various stress conditions.

Lactate dehydrogenases； Plant proteins； Hyperthermia，induced； Multigelation； Dehydration

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.10.002

：A

：1009-5519（2015）10-1445-03

2015-03-24）

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本刊編輯部

教育部“春暉計(jì)劃”（Z2007-1-63006）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（No.20070420717）。

何帥（1987-），男，湖南茶陵人，博士研究生，主要從事抗逆分子生物學(xué)的研究；E-mail：61848265@qq.com。