劉 玲，金 蘇，曾文婕，寧 凡，阮 穎

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

不同植物激素誘導(dǎo)擬南芥SDG8的表達(dá)模式

劉 玲，金 蘇，曾文婕，寧 凡，阮 穎*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

與植物激素在植物整個(gè)生命周期中起著多重作用類似，基因SDG8對(duì)植物生長、發(fā)育、代謝、抗性等多個(gè)方面也具多效性。對(duì)擬南芥Col-0和轉(zhuǎn)pSDG8：：GUS植株分別進(jìn)行KT、ABA、GA3、IAA、MeJA和MeSA噴灑處理24 h后，用GUS試劑和RT-qPCR研究SDG8基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，在植物營養(yǎng)生長階段和使用的激素濃度范圍內(nèi)，這6種激素對(duì)SDG8基因的表達(dá)調(diào)控有4種模式：KT高低濃度都抑制表達(dá)；ABA低濃度促進(jìn)表達(dá)，高濃度表達(dá)量下降；GA3低濃度與高濃度促進(jìn)表達(dá)的水平相同；隨IAA、MeJA和MeSA濃度增加表達(dá)水平提高。這些結(jié)果從總體上揭示了植物激素對(duì)SDG8的表達(dá)趨勢(shì)的影響，對(duì)進(jìn)一步研究植物激素與SDG8基因相互作用有一定的參考價(jià)值。

植物激素；擬南芥；SDG8；表達(dá)模式

表觀修飾，如乙?；?、甲基化、泛素化、磷酸化、瓜氨酸化、ADP糖基化的調(diào)控在參與植物生長、發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答的過程中起著重要的作用[1～3]。在這些表觀修飾中，組蛋白賴氨酸甲基化具有重要的地位。組蛋白賴氨酸甲基化由含SET結(jié)構(gòu)域組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HKMT)來催化。目前，已知植物組蛋白賴氨酸甲基化發(fā)生在至少6個(gè)賴氨酸殘基上，5個(gè)在組蛋白3(H3)的5個(gè)賴氨酸殘基 (K4，K9，K27，K36，K79) 上，1個(gè)在組蛋白4(H4)的第20位賴氨酸殘基 (K20)上。每個(gè)賴氨酸有3個(gè)可被甲基化的位置，可形成一、二、三甲基化3種形式。一般在動(dòng)植物中，H3K4和H3K36的二、三甲基化與基因轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，而H3K9二甲基化、H3K27三甲基化與基因沉默相關(guān)[1～4]。

擬南芥SET DOMAIN GROUP 8 (SDG8；又名EFS)由1 759個(gè)氨基酸構(gòu)成，與唯一的釀酒酵母(S.Cerevisiae)H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶SET2高度同源[5]。目前，已知SDG8基因參與植物生長、發(fā)育和生理生化過程的調(diào)控，如SDG8基因調(diào)控開花時(shí)間[6～8]，莖分枝[9，10]，類胡蘿卜素合成[10，11]，育性[12]，植株抗性[13，14]，促進(jìn)種子成熟基因在葉片中異位表達(dá)[15]。SDG8功能缺失導(dǎo)致特異基因座位以及整個(gè)基因組水平的H3K36二、三甲基化水平降低，表明SDG8可能具有其他非特異性功能[2]。

SDG8基因功能的多效性，與植物激素作用的多效性有相似性，那么植物激素與SDG8功能之間有什么關(guān)聯(lián)，這方面研究報(bào)道很少。本研究通過對(duì)擬南芥材料直接外施激素，以研究SDG8的誘導(dǎo)表達(dá)模式，對(duì)植物激素與SDG8基因之間的關(guān)系進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 植物材料生長與激素處理

將擬南芥(Arabidopsisthaliana) Col-0和SLP(以Col-0為背景轉(zhuǎn)pSDG8：：GUS表達(dá)載體的材料，由沈文輝教授提供)[14]的種子鋪在MS培養(yǎng)基上，經(jīng)4℃暗室處理4 d后，轉(zhuǎn)入16 h光照/8 h黑暗的光周期和22℃的生長室中培養(yǎng)。植物激素共6種，每種激素設(shè)2種濃度：激動(dòng)素(KT)濃度為0.5與1 μM，脫落酸(ABA)為0.38與0.57 mM，赤霉素(GA3)為0.1與0.3 mM，吲哚乙酸(IAA)為0.1與0.3 μM，茉莉酸甲酯(MeJA)為5與10 μM，水楊酸甲酯(MeSA)為1與5 μM。對(duì)照分別為溶解各激素的溶劑，KT的對(duì)照為NaOH∶水(V/V=1∶10 000)、GA3和ABA的對(duì)照為乙醇∶水(V/V=1∶10 000)、IAA的對(duì)照為DMSO∶水(V/V=1∶20 000)。分別噴灑于生長20 d的Col-0和SLP植株上，24 h后用于試驗(yàn)。

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

從激素處理24 h后的植株上取大約500 mg葉片，用RNA提取試劑Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取?？俁NA用DNaseI (Promega，USA)37℃消化30 min，然后用stop溶液65℃水浴5 min。cDNA按RT-PCR試劑盒(Fermentas Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，CA)的說明合成，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)或存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析

qPCR分析采用 Maxina SYBR Green ROX qPCR Master Mix試劑(Fermentas)配制反應(yīng)體系，熱循環(huán)在qPCR aparatus Step One Plus instrument (ABI)定量PCR儀器上完成。管家基因ACTIN作為內(nèi)參基因。所有引物序列如SDG8和ACTIN列于表1。qPCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min；然后95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 所有引物序列

1.4 組織化學(xué)觀察

參考Jefferson的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)染色方法[16]，稍作改進(jìn)。取12 d的幼苗浸于GUS染色液中，抽真空15 min，然后37℃溫浴3～15 h。移去染色液，依次用75%和95%(V/V)的酒精清洗。清洗后的材料在70%(V/V)的酒精中保存。用體式顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物激素誘導(dǎo)Col-0中的SDG8表達(dá)情況

激素對(duì)野生型擬南芥Col-0中SDG8的誘導(dǎo)表達(dá)模式較為復(fù)雜，但可以分為4種類型：高低濃度的KT處理都導(dǎo)致SDG8的表達(dá)水平低于對(duì)照20%左右；較低濃度的ABA提高表達(dá)量在4倍以上，較高濃度ABA只提高大約1倍的表達(dá)量；較低濃度與較高濃度GA3都促進(jìn)表達(dá)，表達(dá)量都提高了約50%；IAA、MeJA和MeSA處理，隨濃度的增加SDG8的表達(dá)量上升，具體表現(xiàn)為：對(duì)IAA，0.1 μM表達(dá)上升約2.3倍，0.3 μM表達(dá)上升約3.0倍；對(duì)MeJA，5 μM表達(dá)上升1.4倍，10 μM表達(dá)上升2.5倍；對(duì)MeSA，1 μM表達(dá)上升1.5倍，5 μM表達(dá)上升2.0倍(表2)。

表2 不同激素處理后Col-0的SDG8相對(duì)表達(dá)水平

2.2 不同激素誘導(dǎo)SLP中的GUS表達(dá)情況

SLP是以擬南芥Col-0為背景，轉(zhuǎn)入pSDG8：GUS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株。圖1(封三，上)中藍(lán)色部分反映了SDG8的表達(dá)部位。從圖中可見，KT對(duì)照的藍(lán)色主要在主根部、芽生長點(diǎn)，尤其是根尖；而KT 0.5和1.0 μM處理后的藍(lán)色主要在根尖(主根和側(cè)根)。ABA的對(duì)照在根部有微弱的藍(lán)色，ABA 0.38 mM處理后在根部、子葉、芽生長點(diǎn)有藍(lán)色，ABA 0.57 mM藍(lán)色位置較少，僅葉尖處有積累。GA3的對(duì)照根部有較深的藍(lán)色，GA30.1和0.3 μM處理后的材料在根部、子葉、真葉葉尖、芽生長點(diǎn)都有更強(qiáng)的藍(lán)色。IAA的對(duì)照根部也有較深的藍(lán)色，IAA 0.1 μM處理后的材料除在根部有較深的藍(lán)色外，葉脈與芽生長點(diǎn)也有藍(lán)色，IAA 0.3 μM處理后的材料藍(lán)色則幾乎遍布整個(gè)植株。MeJA和MeSA與IAA處理后的材料藍(lán)色類似。MeJA的對(duì)照根部有較淺的藍(lán)色，MeJA 5 μM處理后的材料在根部、子葉、真葉邊緣等處有較深藍(lán)色，而MeJA 10 μM處理后的材料則與MeJA的對(duì)照藍(lán)色位置相似，但藍(lán)色更深。MeSA的對(duì)照有很淺的藍(lán)色，MeSA 1 μM處理后的材料主要在根部、一片子葉上有較深藍(lán)色，5 μM處理后的材料藍(lán)色著色部位更深。不同激素的各對(duì)照之間藍(lán)色分布情況不相同，可能是溶解各激素的溶劑不同導(dǎo)致的。

3 結(jié)論與討論

目前所知，SDG8對(duì)植物生長發(fā)育具有多重效應(yīng)[3，4]。類似地，植物激素也具多重生理功能。因此，對(duì)植物激素與SDG8相互作用的研究有利于深入了解表觀遺傳在植物激素方面的功能。本研究結(jié)果顯示，植物激素與SDG8之間的關(guān)系復(fù)雜，不同激素處理會(huì)不同程度地增強(qiáng)或抑制SDG8的表達(dá)。這6種激素對(duì)SDG8基因的表達(dá)調(diào)控顯示有4種模式：KT抑制SDG8的表達(dá)；ABA低濃度促進(jìn)表達(dá)，高濃度促進(jìn)作用下降；GA3低濃度與高濃度提高SDG8的表達(dá)水平相同；隨IAA、MeJA和MeSA濃度增加，SDG8的表達(dá)水平提高。

SDG8是通過增強(qiáng)H3K36二、三甲基化水平，進(jìn)而改變?nèi)旧w某些特定位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，從而激活某些基因的表達(dá)。在營養(yǎng)生長階段，不同激素對(duì)SDG8的功能需求可能很不相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，KT抑制SDG8的表達(dá)，說明在營養(yǎng)生長階段，KT功能的實(shí)現(xiàn)是建立在抑制依賴SDG8激活表達(dá)的一類基因的基礎(chǔ)之上。相反，在營養(yǎng)生長階段，ABA、GA3、IAA、MeJA和MeSA總體上增強(qiáng)SDG8的表達(dá)，表明這5種激素功能的發(fā)揮，至少有一部分功能的發(fā)揮是需要依賴SDG8的H3K36二、三甲基的作用。比如JA增強(qiáng)對(duì)真菌性病害的抵抗能力就需要SDG8的參與。

不同激素誘導(dǎo)SDG8的表達(dá)模式與GUS組織化學(xué)染色后的藍(lán)色深淺分布相似，表明植物激素也許是在轉(zhuǎn)錄水平上通過對(duì)SDG8啟動(dòng)子的順式元件或反式元件來調(diào)控SDG8基因表達(dá)，而不是通過轉(zhuǎn)錄后修飾來調(diào)控SDG8基因的表達(dá)。

[1] Strahl BD，Allis CD.The language of covalent histone modifications[J].Nature，2000，403：41-45.

[2] Martin C，Zhang Y.The diverse functions of histone lysine methylation[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2005，6(11)：838-849.

[3] Liu C，Lu F，Cui X，et al.Histone methylation in higher plants[J].Annual Review of Plant Biology，2010，61：395-420.

[4] Berger SL.The complex language of chromatin regulation during transcription[J].Nature，2007，447：407-412.

[5] Strahl BD，Grant PA，Briggs SD，et al.Set2 is a nucleosomal histone H3-selective methyltransferase that mediates transcriptional repression[J].Mol Cell Biol，2002，22(5)：1298-1306.

[6] Xu L，Zhao Z，Dong A，et al.Di-and tri-but not monomethylation on histone H3 lysine 36 marks active transcription of genes involved in flowering time regulation and other processes inArabidopsisthaliana[J].Mol Cell Biol，2008，28(4)：1348-1360.

[7] Zhao Z，Yu Y，Meyer D，et al.Prevention of early flowering by expression of FLOWERING LOCUS C requires methylation of histone H3 K36[J].Nature Cell Biology，2005，7(12)：1256-1260.

[8] Ko JH，Mitina I，Tamada Y，et al.Growth habit determination by the balance of histone methylation activities inArabidopsis[J].The EMBO Journal，2010，29(18)：3208-3215.

[9] Dong G，Ma DP，Li J.The histone methyltransferaseSDG8 regulates shoot branching inArabidopsis[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，373(4)：659-664.

[10] Cazzonelli CI，Cuttriss AJ，Cossetto SB，et al.Regulation of carotenoid composition and shoot branching inArabidopsisby a chromatin modifying histone methyltransferase，SDG8[J].The Plant Cell Online，2009，21(1)：39-53.

[11]Cazzonelli CI，Roberts AC，Carmody ME，et al.Transcriptional control of SET DOMAIN GROUP 8 and CAROTENOID ISOMERASE duringArabidopsisdevelopment[J].Mol Plant，2010，3(1)：174-191.

[12]Grini PE，Thorstensen T，Alm V，et al.The ASH1 HOMOLOG 2 (ASHH2) histone H3 methyltransferase is required for ovule and anther development inArabidopsis[J].PLoS One，2009，4(11)：e7817.

[13]Palma K，Thorgrimsen S，Malinovsky FG，et al.Autoimmunity inArabidopsisacd11 is mediated by epigenetic regulation of an immune receptor[J].PLoS Pathogens，2010，6(10)：e1001137.

[14]Berr A，McCallum EJ，Alioua A，et al.Arabidopsishistone methyltransferase SET DOMAIN GROUP8 mediates induction of the jasmonate/ethylene pathway genes in plant defense response to necrotrophic fungi[J].Plant Physiol，2010，154(3)：1403-1414.

[15]Tang X，Lim MH，Pelletier J，et al.Synergistic repression of the embryonic programme by SET DOMAIN GROUP 8 and EMBRYONIC FLOWER 2 inArabidopsisseedlings[J].J Exp Bot，2012，63(3)：1391-1404.

[16]Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW.GUS fusions：beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J].The EMBO Journal，1987，6(13)：3901.

Expression Patterns ofSDG8 Gene inArabidopsisthalianaInduced by Different Plant Hormones

LIU Ling，JIN Su，ZENG Wen-jie，NING Fan，RUAN Ying*

(College of Bio-science and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

Plant hormones play multiple roles during the whole life of plant，andSDG8 gene also has pleiotropic effects on plant growth，development，metabolism，resistance and so on，but the crosstalk between plant hormones andSDG8 remains elusive.The expression patterns ofSDG8 were investigated by qPCR and GUS assay after the treating ofArabidopsisthalianaCol-0 and pSDG8：：GUS with KT，ABA，GA3，IAA，JA and SA.The results indicated that there were fourSDG8 expression models，lower and higher concentration KT suppressedSDG8 gene expression，lower ABA promoted expression while higher ABA reduced expression，GA3enhanced expression at the same level under lower and higher concentration，IAA，MeJA and MeSA increased expression with the increment of concentration.These results gave us an overall understanding the expression trend of plant hormones affected onSDG8，which were worthy for further research on interaction of plant hormones andSDG8 genes.

phytohormones；Arabidopsisthaliana；SDG8；expression patterns

2015-01-27

劉 玲(1989-)，女，湖南湘潭人，碩士研究生，Email：lingling9910@163.com。

*通信作者：阮穎，教授，Email：yingruan@hotmail.com。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071455)。

Q786；Q946.885

A

1001-5280(2015)03-0226-04

10.3969/j.issn.1001-5280.2015.03.02