孫 芳，郇 通，潘 云，李 艷*

（1.大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理 671000；2.大理大學附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

蛋白甲基轉移酶（EZH2）與果蠅zeste 基因增強子同源，是多梳蛋白抑制復合物2（PRC2）蛋白復合物（Ploycmb Repressive Complex 2）的一個催化亞基，通過SET 結構域催化組蛋白H3 賴氨酸第27 號位的三甲基化（H3K27me3），進一步介導轉錄抑制〔1〕。其在疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已經得到共識，成為當前研究的熱點。研究表明，EZH2的過表達在許多不同類型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)，比如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等，與腫瘤的侵襲、演化以及不良預后有關〔2-5〕。在血液系統(tǒng)腫瘤中，EZH2 的過表達已經在成人T 細胞白血病/淋巴瘤、Burkitt’s 淋巴瘤、T/NK細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤（MCL）、慢性淋巴細胞白血?。–LL）、B 細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）、彌漫大B 細胞淋巴瘤（DLBCL）等多種淋巴系統(tǒng)腫瘤中被證實〔6-9〕。在神經系統(tǒng)腫瘤中，EZH2 與神經膠質瘤，惡性外周神經鞘膜瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展、分級及治療密切相關〔9-10〕。盡管EZH2在神經系統(tǒng)腫瘤中意義重大，EZH2 致腫瘤發(fā)生的作用機制大部分仍不清楚，目前的國內外基礎研究也相當有限。我們成功建立了小鼠胚胎干細胞體外分化體系，觀察EZH2 在胚胎干細胞誘導分化為神經細胞過程中的蛋白表達變化，為以后對EZH2蛋白功能與作用機制的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞系小鼠胚胎干細胞系E14Tg2A.4。

1.2 主要試劑、儀器設備及來源明膠（Millipore，ES-006-B）；DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco’s minimal essential medium，Specialty media，SLM-220-M）；胎牛血清（Hyclone，SH30071.03）；非必需氨基酸（Specialty media，TMS-001-C）；2-巰基乙醇（Specialty media，ES-007-E）；L-谷氨酰胺（Specialty media，TMS-002-C）；核苷酸（Specialty media，ES-008-D）；青霉素-鏈霉素（Specialty media，TMSAB-2C）；1 000 U/mL血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF；ESGRO，Millipore ESG1107）；胰酶（tryple express Gibco:ref:12605-028，lot:1248224）；DMSO（sigma，D2650）；DPBS（REF14190144）；維甲酸（RA，sigma，R2625-50MG）；逆轉錄酶試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，fermentas）；Taq酶，F(xiàn)ast Green Master（ROX）（04913914001，Roche）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，P0010S）；超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（碧云天，P0018）；EZH2一抗（BD Biosciences，612666）；EZH2 二抗（Abcam ab6709）；熒光定量PCR 儀（CFX96TMReal-Time system C1000，Bio-Rod）；ECL 化學發(fā)光（thermo，Prod#34080）；倒置顯微鏡（Primo Vert，ZEISS）；Western blot所用電泳儀等為Bio-rad公司生產；顯影設備為ImageQuant LAS 4000系統(tǒng)。

1.3 RA誘導小鼠胚胎干細胞向神經細胞分化實驗E14Tg2A.4 培養(yǎng)在預鋪有明膠涂層的細胞培養(yǎng)皿中，加入DMEM 完全培養(yǎng)基：80%DMEM 培養(yǎng)基，15%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%2-巰基乙醇，1%L-谷氨酰胺，1%核苷酸，1%青霉素-鏈霉素，1 000 U/mL血病抑制因子。在鋪有明膠的10 cm培養(yǎng)皿中，DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d 后，收集細胞1.5×106，將細胞沉淀標記為第0 天（D0），同時按照1.5×106/10 cm 培養(yǎng)皿的密度種植于 5 個 10 cm 細胞培養(yǎng)皿，在撤去LIF 的DMEM 完全培養(yǎng)基中加入維甲酸（濃度為5×10-7mol/L）進行誘導，其間每天換液，第5 天誘導結束。于誘導分化第1 天（D1）、第2天（D2）、第3天（D3）、第4天（D4）、第5天（D5）收集細胞沉淀，標號。細胞培養(yǎng)期間每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并拍照保存。

1.4 RT-PCR 在干細胞分化過程中，按固定時間收獲細胞，用TRN2ol 試劑提取RNA，然后用Super-Script III 逆轉錄酶，oligo（dT）作為引物合成cDNA，用SYBR green法作定量PCR反應。

1.5 Western blot 將收獲的D0至D5細胞沉淀，用RIPA 裂解法制備全細胞裂解液，超聲破碎，測蛋白濃度，按照 60 μg 的上樣量進行 Western blot，用SDS-PAGE 蛋白電泳法分離蛋白，用濕轉膜的方法把蛋白轉移到硝酸纖維素膜上（轉膜條件：4 ℃，恒流，360 mA，1 h），3%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗室溫孵育 1 h，TBST 洗 3 次，5 min/次，然后二抗孵育1 h，TBST 洗 3 次，5 min/次，ECL 化學發(fā)光，孵育5 min，ImageQuant LAS 4000 系統(tǒng)顯影，應用Image Quant TL軟件分析圖像，計算相對蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計學處理對各組的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。用SPSS17.0軟件統(tǒng)計包進行統(tǒng)計，多組間的比較采用方差分析，總體差異顯著后，進行Post Hoc兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胚胎干細胞誘導分化過程中細胞形態(tài)上的變化形態(tài)學觀察可見，胚胎干細胞（ESCs）呈橢圓或圓形，細胞核大，核仁明顯。加入RA誘導1 d后，細胞逐漸變?yōu)槿切位蚨噙呅蜗蛲鈹U展，隨后的幾天開始伸出突起，變細變長，與鄰近細胞交織成網(wǎng)，在誘導5 d后，形成密集的神經樣網(wǎng)絡，神經樣細胞多呈雙極性，胞體圓亮。整體來看，細胞形態(tài)已趨于一致。見圖1。

圖1 胚胎肝細胞誘導分化過程中細胞形態(tài)變化

2.2Real-Time PCR驗證胚胎干細胞標記物和神經細胞早期分化標記物結果胚胎干細胞標記Sox2、Oct3/4、Nanong 在誘導過程中mRNA 表達水平大幅度下降，神經細胞早期分化標記物Nestin、Tuj1、NeuroD、Nestin 在誘導過程中mRNA 表達水平大幅度上升。結合從細胞形態(tài)學變化和Real-Time PCR分析結果，確定小鼠胚胎干細胞向神經細胞誘導分化成功。見圖2～3。

圖2 胚胎干細胞標記物Sox2、Oct3/4、Nanong 在ESCs向神經細胞分化過程中mRNA的表達變化

圖3 神經細胞早期分化標記物Nestin、NeuroD、Tuj1在ESCs向神經細胞分化過程中mRNA的表達變化

2.3胚胎干細胞向神經細胞分化過程中EZH2蛋白表達水平變化EZH2在小鼠胚胎干細胞中蛋白表達水平比較高（D0）。在撤去LIF 加入RA 誘導向神經干細胞分化1 d 后，EZH2 表達水平仍然較高。在RA 的持續(xù)作用下從第2 天開始EZH2 表達水平逐漸下降，在第5天降至最低。見圖4～5。

圖4 EZH2在ESCs向神經細胞分化過程中蛋白表達量的變化

圖5 在ESCs向神經細胞分化過程EZH2/β-actin相對蛋白含量的變化

3 討論

本實驗成功誘導了小鼠胚胎干細胞向神經細胞的分化，并且觀察到EZH2 蛋白在小鼠胚胎干細胞中表達水平比較高（第0天），在撤去LIF加入RA誘導向神經胞分化1 d后EZH2表達水平仍然較高，在RA 的持續(xù)作用下從第2 天開始EZH2 表達水平逐漸下降，在第5天降至最低的變化?？偟膩碚f，本實驗建立了小鼠胚胎干細胞向神經細胞分化的體系，觀察到與神經發(fā)育疾病相關的EZH2 蛋白在神經細胞發(fā)育過程中的特異性表達變化，為下一步研究EZH2的作用機制打下了基礎。

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