鄧榮華，王 穎，王 慧，郭曉宏，魏學智

(山西師范大學 生命科學學院，山西 臨汾 041004)

紅柄白鵑梅葉中黃酮類物質(zhì)的提取研究

鄧榮華，王 穎，王 慧，郭曉宏，魏學智*

(山西師范大學 生命科學學院，山西 臨汾 041004)

采用乙醇提取，用分光光度法測定的方法，以紅柄白鵑梅為原料，通過正交試驗研究了乙醇濃度，提取溫度，提取時間和料液比4個因素對提取紅柄白鵑梅葉片中總黃酮含量的影響。研究結果表明，各試驗因素對紅柄白鵑梅葉中黃酮類物質(zhì)提取量的影響依料液比、提取溫度、乙醇濃度、提取時間因素順次降低，當提取溫度為70 ℃、提取時間為2 h、料液比為1 ∶20時，提取效果最好,黃酮類物質(zhì)提取量為22.412 mg/g。

紅柄白鵑梅；黃酮類；提取

紅柄白鵑梅(Exochordagiraldii)又名金瓜果、輪板芽，屬薔薇科白鵑梅屬落葉灌木，廣泛分布于河南、陜西、湖北、山西、江蘇和甘肅等地，山西境內(nèi)主要分布于呂梁山、太岳山、中條山等山區(qū)，海拔約700 m～1 600 m處[1]。紅柄白鵑梅是一種天然的綠色食品，是山西臨汾洪洞等山區(qū)民間的傳統(tǒng)野菜。春季時節(jié)采摘其嫩莖、幼葉和花蕾，用開水淖后涼拌味鮮可口，還可以和面蒸食、炒食。也可以鹽漬、晾干制成干菜長期保存以備食用，或制作罐頭[2]。除此之外，它還可作為退耕還林樹種，既有經(jīng)濟價值又有生態(tài)效益，而且具有觀賞價值。近年來，關于植物黃酮類物質(zhì)種類、功能作用及提取的研究受到廣大學者的青睞[3-10]，天然植物黃酮類物質(zhì)具有抗菌、消炎、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿以及清除氧自由基等多種重要的生物活性[11-12]，并且其提取物已廣泛應用于藥品、化妝品、食品等產(chǎn)品中[13-14]。

我國紅柄白鵑梅具有豐富的野生資源，但長期以來利用率極低僅限于局部地區(qū)采集食用,基本上處于自生自滅狀態(tài)，沒有充分開發(fā)利用[15]。有學者對紅柄白鵑梅中的營養(yǎng)成分[15-16]、引種栽培[17]以及在山西霍山的群落特征[18]進行了研究，但有關紅柄白鵑梅中黃酮類物質(zhì)的研究尚未見報道。本研究采用乙醇提取，用分光光度法測定的方法，通過正交試驗研究乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比4個因素對提取紅柄白鵑梅葉片中總黃酮含量的影響。從而對紅柄白鵑梅葉中黃酮類物質(zhì)的含量進行初步分析研究，不僅為開發(fā)利用白鵑梅資源提供科學依據(jù)，而且為農(nóng)村調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構和脫貧致富提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

紅柄白鵑梅葉：山西省臨汾市堯都區(qū)河底鄉(xiāng)、枕頭鄉(xiāng)采集的紅柄白鵑梅幼葉，烘干后粉碎。

蘆丁標準品(國藥集團化學試劑有限公司)；C2H5OH, NaNO2, NaOH, Al(NO3)3所有試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

DELI-500A型中藥粉碎機(廣州大祥電子機械設備有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)；WFJ-7200型可見光分光光度計(上海龍尼柯儀器有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；101-3BS型電熱鼓風干燥箱(金壇市榮華儀器有限公司)；FA1004A型電子天平(上海維菱科學儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理

于4月份選取生長較茂盛的紅柄白鵑梅植株，采摘無病蟲害的葉片，洗凈晾干，50～60 ℃烘箱干燥，粉碎過篩(60目)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標準曲線的繪制

參照梁曉華等人[6]總黃酮的測定方法。

準確稱取蘆丁標準品5.0 mg，濃度60%微熱乙醇溶液定容至50 mL，搖勻，得濃度0.1mg/mL 的標準液。準確吸取標準應用液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0 mL于6只比色管中，加濃度30%乙醇至5 mL，加0.3 mL濃度5 % NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，加0.3 mL濃度10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min，加4 mL濃度1 mol/L NaOH溶液，加0.4 mL蒸餾水，搖勻，靜置15 min，以試劑作為空白參比液，于510 nm波長處測定吸光度A。以吸光度值A為縱坐標，濃度C(mg/mL) 為橫坐標進行線性回歸，求取線性方程。

得出線性回歸方程：A=0.011 3C+0.000 5(R2=0.999 8)

圖1 蘆丁的標準曲線

1.2.3 紅柄白鵑梅葉黃酮類化合物的提取與測定

本實驗以70%的乙醇為提取溶劑，超聲波萃取40 min，抽濾得到提取液。

樣品含量測定：準確吸取提取液0.2 mL置于潔凈的試管中，加濃度30%的乙醇至5 mL，按標準曲線的制備方法測定吸光值A，計算紅柄白鵑梅葉中總黃酮的含量。

1.2.4 單因素試驗

按照1.2.3的方法對紅柄白鵑梅中黃酮類化合物進行提取，并分別考察乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間對黃酮類化合物得率的影響。

1.2.4.1 乙醇濃度對黃酮類物質(zhì)提取的影響

在料液比為1 g ∶30 mL，提取溫度為50 ℃，提取時間為2 h的條件下，考察不同的乙醇濃度(10%，30%，50%，70%，90%)對紅柄白鵑梅中黃酮類化合物得率的影響

1.2.4.2 提取溫度對黃酮類物質(zhì)提取的影響

在料液比為1 g ∶30 mL，乙醇濃度為50%，提取時間為2 h的條件下，考察不同溫度(30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃ ，70 ℃，80 ℃)對紅柄白鵑梅中黃酮類化合物得率的影響。

1.2.4.3 料液比對黃酮類物質(zhì)提取的影響

在提取溫度為50 ℃，乙醇濃度為50%，提取時間為2 h的條件下，考察不同料液比(1 ∶5，1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40)對紅柄白鵑梅中黃酮類化合物得率的影響。

1.2.4.4 提取時間對黃酮類物質(zhì)提取的影響

在提取溫度為50 ℃，乙醇濃度為50%，料液比為1 g ∶30 mL的條件下，考察不同提取時間(1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h)對紅柄白鵑梅中黃酮類化合物得率的影響。

1.2.5 正交實驗

黃酮類化合物的提取過程受多個因素影響，為了得到較科學的提取工藝條件，將料液比、提取溫度、乙醇濃度和提取時間4個單因素為考察對象，設計四因素四水平L16(44)的正交試驗，優(yōu)化提取工藝。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對紅柄白鵑梅葉黃酮類化合物提取的影響

圖2 乙醇濃度對黃酮得率的影響

由圖2曲線可以看出，在乙醇濃度為10%時，黃酮的得率最低，隨著乙醇濃度的升高，當達到50%時，得率達到最大值，而后隨著乙醇濃度的升高得率下降，并且脂溶性的物質(zhì)溶出增多，尤其是葉綠素幾乎完全溶出，給提純?nèi)ルs帶來較大的麻煩[7]。從成本和提取率來考慮，乙醇濃度最好控制在30%～60%為好。

2.2 溫度對紅柄白鵑梅葉黃酮類化合物提取的影響

圖3 提取溫度對黃酮得率的影響

由圖3曲線可知，在30 ℃～60 ℃之間，隨著溫度的升高，所得提取物中黃酮含量呈上升趨勢，在60 ℃時，黃酮得率達最大值，之后隨著溫度的升高，提取物含量有下降趨勢，可能是因為溫度過高，一方面其中的活性成分會收到破壞，雜質(zhì)的溶出量增加；另一方面也會造成溶劑的損失。綜合以上兩方面的因素，提取時適宜的溫度應為50～70 ℃。

2.3 料液比對紅柄白鵑梅葉黃酮類物質(zhì)提取的影響

圖4 料液比對黃酮得率的影響

由圖4曲線可知，在料液比為1 ∶5～1 ∶15之間，隨著所加試劑量的增加，所得提取物含量呈上升趨勢，在1 ∶20時，黃酮得率達最大值，之后隨著所加試劑量的進一步增加，所得提取物含量有下降趨勢。從提取效果和減少溶劑用量等方面綜合考慮，用量應不宜過大，故料液比定在1 ∶5～1 ∶20之間比較合適。

2.4 提取時間對紅柄白鵑梅葉黃酮類物質(zhì)提取的影響

圖5 提取時間對黃酮得率的影響

由圖5曲線可知，在提取時間為1 h～2 h之間，隨著時間的延長，所得提取物中黃酮含量有上升趨勢，在2 h時，得率達最大值，之后隨著時間的延長，提取物含量有下降趨勢，這可能由于長時間作用破壞了黃酮，在后處理過程中損失增大而影響黃酮的提出率，造成負面影響。從節(jié)省原料及實驗周期等各方面考慮，提取時間控制在1.5 h～2.5 h為宜。

2.5 正交結果與分析

由表1可知，最佳工藝組合為：料液比1 ∶20，溫度70 ℃，濃度30%，時間2 h，此條件下所得紅柄白鵑梅葉中黃酮類物質(zhì)的提取量為22.412 mg/g。由表2方差分析可知，4個因素對黃酮提取率的影響，料液比和溫度對提取的影響較為明顯，濃度和時間的影響相對較小，即：料液比>溫度>濃度>時間。

表1 正交試驗結果L16(44)

表2 正交試驗結果方差分析

3 結 論

本研究采用乙醇提取，用分光光度法測定的方法，通過四因素四水平正交試驗研究了乙醇濃度，提取溫度，提取時間和料液比4個因素對提取紅柄白鵑梅葉片中總黃酮含量的影響，得到各因素對提取率的影響程度為：料液比>溫度>濃度>時間。最佳工藝組合為：料液比1 ∶20，溫度70 ℃，濃度30%，時間2 h，此條件下所得紅柄白鵑梅中黃酮類物質(zhì)的提取量為22.412 mg/g。初步研究表明：紅柄白鵑梅營養(yǎng)價值豐富，是一種極具開發(fā)利用的野生資源。

[1] 山西植物志編輯委員會. 山西植物志:第2卷[M]. 北京:中國科學技術出版社, 1998: 216 - 219.

[2] 趙玉平, 魏學智, 趙國建.中國溫帶野菜加工工藝[M]. 太原:山西科學技術出版社, 2001:1 - 71.

[3] 陳彥, 林曉艷, 楊志榮. 箭竹葉黃酮類物質(zhì)提取條件的優(yōu)化[J]. 食品科學, 2003, 24(1): 80-83.

[4] 何書美,劉敬蘭. 芹菜中黃酮類物質(zhì)的提取和測定[J]. 分析試驗室, 2006, 25(8)：84-87.

[5] 朱宇旌, 張勇, 王純剛, 等. 紅三葉黃酮抗氧化性研究[J]. 食品科技, 2006(4): 78-81.

[6] 梁曉華,徐成東,王陸琴.云南13種蕨類植物中總黃酮的測定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008, 36(19): 7965-7966, 7973.

[7] 李鳳林. 超聲波法提取甘薯葉總黃酮的工藝研究[J].江蘇調(diào)味副食品，2008, 25(3):15.

[8] 唐維媛, 董永康, 王嘯, 等.貴州特產(chǎn)苦蕎麥中總黃酮的提取[J]. 貴州工業(yè)大學學報：自然科學版. 2008, 37(4): 178-181.

[9] 馬曉麗. 生物類黃酮的研究進展[J]．山西職工醫(yī)學院學報, 2005, 15(2): 113-116.

[10] 高中松, 丁文, 高亮, 等. 超聲波提取桑葉中總黃酮的工藝研究[J]. 中國農(nóng)學通報, 2006, 24(4): 122-125.

[11] Rice Evans C, Miller N. The relative anthioxidant activities of plant derived ployphenloic flavonoidsfs[J]. Free Radicalres, 1995, 22(4): 375-383

[12] Lichtblau D, Berger J M, Naknaishi K. Eficient extraction of ginkgolides and bilobalide from Ginkgo biloba leaves[J]. Nat Prod, 2002, 65(10): 1501-1504.

[13] 凌關庭. 天然食品添加劑[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2000：214-308, 600-601.

[14] 肖崇厚, 陸蘊如. 中藥化學[M].上海: 上?？萍汲霭嫔? 1987：191-250.

[15] 魏學智, 劉少華, 師學琴, 等. 紅柄白鵑梅營養(yǎng)成分的分析[J].西北植物學報, 2005, 25(8):1657-1660.

[16] 戢小梅, 陳法志, 董艷芳, 等. 白鵑梅可食部分營養(yǎng)成分分析[J]. 園藝與種苗, 2011(4):89-90, 107.

[17] 王軍濤, 高小寧, 查振道. 秦嶺野生紅柄白鵑梅引種栽培[J]. 園林綠化, 2008, 3:43-44.

[18] 張欽弟, 畢潤成. 山西霍山紅柄白鵑梅群落特征的研究[J]. 山西師范大學學報:自然科學版, 2006, 20(4):81-84.

Research of Extracting Flavonoids fromEcochordagiraldii

Deng Ronghua, Wang Ying, Wang Hui, Guo Xiaohong, Wei Xuezhi*

(College of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen 041004, China)

In this paper, we usedEcochordagiraldiias raw material. The content of flavonoids inEcochordagiraldiiwas extracted by ethanol and determined by spectrophotometry. The orthogonal test was adopted to study the effects of four factors including ratio of material to liquid, extracting temperature, ethanol concentration, extracting time on the extraction rate of flavonoids fromEcochordagiraldiileaves. The results showed that the processing conditions affected the yield, and that the effect of each condition decreased in the following order: ratio of material to liquid, extracting temperature, ethanol concentration, extracting time. The optimum condition of extracting total flavonoids was with 70% ethanol, ratio of material to liquid of 1 ∶20, at 70 ℃, for 2 h, under which the total flavonoids yield could reach 22.412 mg/g.

Exochordagiraldii; flavonoids; extraction

2014-08-21

國家自然科學基金(30972396;31300157)；山西省自然科學基金項目資助(2009011041-1)。

鄧榮華(1990-)，女，碩士研究生，主要從事植物中活性成分的研究。

*通訊作者：魏學智，教授，主要從事植物學的科研和教學工作。E-mail:wxz3288@163.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.02.002

Q946.8;Q949.91

A

1006-9690(2015)02-0005-04