王苑螈, 王秀英, 薛 永, 姚泉洪, 查丁石, 彭日荷, 龔繁榮, 朱玉英

(1. 上海海洋大學 食品學院 上海 201306; 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106; 3.上海市農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，上海 201106)

利用SSR分子標記構(gòu)建甜椒自交系的指紋圖譜

王苑螈1， 2, 王秀英2, 薛 永2, 姚泉洪2, 查丁石3, 彭日荷2, 龔繁榮3, 朱玉英3

(1. 上海海洋大學 食品學院 上海 201306; 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106; 3.上海市農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，上海 201106)

實驗選用112對SSR引物對10個甜椒自交系進行擴增，綜合考慮擴增帶的清晰度、多態(tài)性、引物重復(fù)性等，篩選出CM2、CM26、CM28、CM46、CM52、CM53、CM62、CM63、CM76、CM77、CM86和CM96這12對引物，構(gòu)建出10個甜椒自交系的指紋圖譜。其中僅用1對引物就能辨別的供試材料有4組，2對引物組合方能辨別的有2組，需3對引物組合才能有效區(qū)分的為余下的4組。說明利用SSR分子標記構(gòu)建甜椒自交系的指紋圖譜是行之有效的，可為知識產(chǎn)權(quán)保護提供科學依據(jù)。

甜椒； 自交系； SSR； DNA指紋圖譜

簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat, SSR)，是指染色體上一類由幾個核苷酸(一般1～5個)為重復(fù)單位組成的串聯(lián)序列[1]。SSR標記技術(shù)，是第二代分子標記技術(shù)，在動植物基因組中具有隨機分布、高信息量、高多態(tài)性頻率、孟德爾遺傳和PCR方法的優(yōu)點，且表現(xiàn)為共顯性，可用來鑒定基因型的純合與否，廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定，并涉及構(gòu)建遺傳圖譜、分析遺傳多樣性、鑒定親緣關(guān)系、標記功能基因等領(lǐng)域[2-3]。Nandakumar等[4]、楊文鵬等[5]、孫寧等和宋海斌等[7]在水稻、玉米、棉花和甜瓜等作物的實驗研究上已得到了證明,并建立了部分品種的SSR指紋圖譜。利用此技術(shù)的多位點性、高變異性和遺傳穩(wěn)定性，可以對未了解透徹的育種領(lǐng)域加以研究，建立大部分育種材料的指紋圖譜，彌補系譜記載的缺失。目前甜椒DNA指紋圖譜的研究還比較缺乏，本研究即利用SSR分子標記技術(shù)建立上海市農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所優(yōu)良甜椒品種的指紋圖譜，以便為知識產(chǎn)權(quán)保護提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

表1所列為上海市農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所的10個甜椒自交系品種。

表1 供試材料的名稱及編號

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

每組實驗材料分別取6～9粒種子，于暗環(huán)境下恒溫培養(yǎng)7 d。采用Dellaporta等提出的SDS法提取葉片總DNA，并純化，用TE緩沖液(10 mM Tris base, 0.1mM EDTA)保存[8]。測定葉片總DNA在紫外波長下的吸光值，并計算出其質(zhì)量和濃度，適當稀釋樣品備用。

1.2.2 PCR擴增

PCR擴增反應(yīng)體系：每20μL體積中含1×Buffer， 2.5 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTP，SSR引物(前引物和后引物)各0.25 μmol/L，1 UTaqDNA聚合酶，20 ng DNA模板。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

1.2.3 PAGE膠電泳

100mL 8%凝膠工作液配方為：ddH2O 70 mL，10×TBE 10 mL，40%丙烯酰胺(19∶1) 20 mL，TEMED 100 μL，10%AP 1000 μL。其中，10×TBE是將108 g Tris堿和55 g硼酸先溶解于蒸餾水，加入40 mL 0.5 mol/L EDTA (pH值8.0)，再加ddH2O定容到1 000 mL；40%丙烯酰胺19∶1(100 mL)是將38 g丙烯酰胺和2 g N′, N′-亞甲雙丙烯酰胺溶于雙蒸水中，然后定容到100 mL，過濾除菌后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 銀染顯色

銀染程序參照Sanguinetti等[9]的方法， 用裝有熒光燈的燈箱對DNA條帶進行觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

譜帶按0/1系統(tǒng)記錄，有帶計為1，無帶計為0，數(shù)據(jù)缺失計為9，建立數(shù)據(jù)庫。按Smith等[12]提供的公式計算每對SSR引物的多態(tài)性信息量(polymorphism information content, 簡稱PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記測定結(jié)果

本實驗最終在112對SSR擴增引物中獲得了12對多態(tài)性好且條帶清晰的引物，典型譜帶結(jié)果和多態(tài)性信息如圖1和表2所示。

圖1 SSR引物 CM76 和 CM96 對甜椒自交系的擴增結(jié)果

12對引物總體分布在甜椒的6個連鎖群上，在10份材料中共擴增出35條多態(tài)性條帶，譜帶大小在50～1500 bp之間。實驗中擴增條帶數(shù)少則1條，多達7條，平均每對引物擴增譜帶2.9條，而引物CM86擴增出的多態(tài)性譜帶最多，為7條。

表2 具有多態(tài)性的SSR引物

Table 2 Descriptions of SSR markers polymorphic in pepper

圖2 12 對SSR 引物對甜椒自交系的擴增圖譜

Fig 2 Amplification profiles of bell pepper inbred lines by 12 pairs of SSR primers

2.2 SSR標記構(gòu)建指紋圖譜的結(jié)果

根據(jù)譜帶顯示結(jié)果，選出在大部分實驗材料中用一條主譜帶就能將供試材料區(qū)分開，且多態(tài)性和重復(fù)性皆較好的SSR引物，用來構(gòu)建本實驗的指紋圖譜。其中有CM2、 CM26、CM28、CM46、CM53、CM62、 CM63、CM76、CM77、CM86和CM96這12對引物可將供試材料區(qū)分開。引物CM63對材料4的識別表型明顯；材料5可被引物CM28識別；引物CM76可識別材料4和6；引物CM86對材料4和5表型明顯；而引物CM96對材料6表型明顯；材料10可單獨被引物CM46和CM62辨別；引物CM2與引物CM77組合可識別材料1；引物CM86與CM96組合可區(qū)分材料8；引物CM2、CM63與CM77組合區(qū)分材料2；引物CM46、PCM76與CM77的組合來區(qū)分材料3；引物CM46、CM86與CM96組合區(qū)分材料7；而材料9可由引物CM52、CM86與CM96組合來區(qū)分。

3 討論

本實驗根據(jù)理想擴增條帶的綜合特點，篩選出適用于構(gòu)建甜椒自交系指紋圖譜的12對SSR引物。然而，在實驗中存在個別供試材料，無法用通用性引物將其區(qū)別，只能用個別多態(tài)性信息量較少的引物或其組合來識別，因而此引物也被保留，如本實驗中的CM86，與其他引物組合可以區(qū)分材料7。由于篩選SSR引物工作的繁重性和復(fù)雜性，不僅浪費人力物力還會增加實驗成本，可以對那些已經(jīng)被驗證且被用來建立了圖譜的引物進行整理分類，建立一個指紋圖譜引物核心庫，以便于后續(xù)各研究者參考應(yīng)用。

譚君等[10]和郝晨陽等[11]都曾嘗試利用計算機應(yīng)用軟件系統(tǒng)自動識別供試材料的DNA指紋圖譜，對擴增片段進行精確定位和分析大小，這樣既省時高效，還可盡量避免個體分析誤差。另外,在本研究的后續(xù)工作中，不僅選擇了基因組的序列來設(shè)計引物，還利用EST設(shè)計了一批EST-SSR引物；利用EST-SSR引物可以直接鑒定出控制性狀的基因標記，這些標記結(jié)合甜椒表型可用來進一步進行基因功能分析的研究。

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Construction of fingerprints for pepper inbred line by SSR markers

WANG Yuan-yuan1, 2, WANG Xiu-ying2, XUE Yong2, YAO Quan-hong2,ZHA Ding-shi3, PENG Ri-he2, GONG Fan-rong3, ZHU Yu-ying3

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetic Breeding; Biotech Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106; 3. Shanghai Key Laboratory of Facility Horticulture, Horticultural Research Institute, Shanghai 201106, China)

s Amplification was carried out on 10 bell pepper inbred lines used by 112 pairs of SSR primers in this experiment. Considering of the articulation, polymorphism, and repetitiveness of primers, CM2, CM26, CM28, CM46, CM52, CM53, CM62, CM63, CM76, CM77, CM86 and CM96 were selected to construct fingerprints of the bell peppers. Four materials can be determined under its characteristic spectral bands by one pair of primers, and there are two materials need two. Three pairs of primers can effectively distinguish the rest four groups. Using SSR molecular marker to build fingerprints of sweet pepper inbred lines is efficacious， and it can provide good protection for the intellectual property rights of pepper inbred lines.

pepper; inbred lines; SSR; DNA fingerprinting

2015-01-07；

2015-02-25

國家自然科學基金(30800602)；上海市浦江人才計劃項目(11PJ1408500)；上海市農(nóng)業(yè)科學院“攀高計劃”項目

王苑螈，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學，E-mail:yuanyuanw29@163.com；

姚泉洪，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為植物和微生物基因工程，E-mail:yao.quanhong65@yahoo.com。

S641.3

B

2095-1736(2015)05-0096-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.096