周 陽， 袁少飛， 蔣廷亞， 韓邦興， 高 力， 陳乃富

(1. 江蘇大學 生命科學研究院， 鎮(zhèn)江 212013；2. 皖西學院生物與制藥工程學院 中藥研究與開發(fā)工程技術(shù)研究中心， 六安 237012)

基因組靶向修飾技術(shù)研究進展

周 陽1， 袁少飛1， 蔣廷亞1， 韓邦興2， 高 力1， 陳乃富2

(1. 江蘇大學 生命科學研究院， 鎮(zhèn)江 212013；2. 皖西學院生物與制藥工程學院 中藥研究與開發(fā)工程技術(shù)研究中心， 六安 237012)

基因組靶向修飾技術(shù)是研究基因功能的重要方法之一，該技術(shù)也被用于人類疾病的治療上，從而成為近來生物學研究的熱點。傳統(tǒng)的靶向修飾技術(shù)由于其效率低、有毒性等缺點注定其將要被更高效、安全的技術(shù)所取代，因此產(chǎn)生了后來的三代基因組靶向修飾技術(shù)：鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和常間回文重復序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9, CRISPR/Cas9)。這3種技術(shù)在克服傳統(tǒng)技術(shù)缺陷的基礎(chǔ)上，也針對其上一代技術(shù)的缺陷進行了自身的改善。對三代基因組靶向修飾技術(shù)，尤其最近發(fā)展起來的CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)組成、作用原理和基因定點修飾中的應用進行闡述，最后對三代基因組靶向修飾技術(shù)進行比較。

基因組靶向修飾； ZFN； TALEN； CRISPR/Cas9

傳統(tǒng)的基因組靶向修飾技術(shù)主要依靠同源重組修復機制，即外源DNA與靶細胞DNA序列自然發(fā)生同源重組，然而其打靶效率非常低，約為百萬分之一，難以真正應用到實踐中。傳統(tǒng)技術(shù)缺點催生了新的基因組靶向修飾技術(shù)的產(chǎn)生，目前包括三代產(chǎn)物，第一代：鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)，第二代：類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)，第三代：常間回文重復序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9, CRISPR/Cas9)。其中，第一代和第二代都是一類人工核酸內(nèi)切酶，由識別靶序列的結(jié)構(gòu)域和非特異性的Fok I核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域組成。ZFN依靠鋅指蛋白來識別靶序列，TALEN則依靠TALE蛋白來識別，所以這兩種技術(shù)的難點就在于識別靶序列元件的構(gòu)建上。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細菌和古細菌中特有的一種針對外源性核酸入侵的免疫系統(tǒng)，通過小片段的RNA靶向定位入侵的核酸，然后由Cas9酶對入侵的核酸進行切割、降解[1]。相對于ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9突變效率高、構(gòu)建簡捷、成本低廉，被廣泛應用。三代技術(shù)的修復機制都是通過非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組修復(Homologous recombination, HR)兩種途徑，從而實現(xiàn)基因靶向修飾。

1 鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)

1.1 鋅指核酸酶的結(jié)構(gòu)

ZFN由鋅指蛋白(Zinc finger protein, ZFP)結(jié)構(gòu)域和Fok I核酸內(nèi)切酶切割結(jié)構(gòu)域人工融合而成。ZFP由多個鋅指(Zinc finger, ZF)基序串聯(lián)而成，識別并結(jié)合特定的DNA序列，三個及以上鋅指基序串聯(lián)才能提高鋅指蛋白的特異性。ZF通常由30個氨基酸殘基組成，折疊形成了ββα的ZFP結(jié)構(gòu)[2]。位于α螺旋區(qū)-1-+6 七個位點決定了ZF結(jié)合DNA序列的特異性，其中-1、+3和+6 三個位點氨基酸殘基的突變可改變ZF識別的特異性，從而增加ZF識別的多樣性[3]，這三個位點能特異性識別并結(jié)合DNA序列上3個連續(xù)的堿基(圖1)。

圖1 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)示意圖[4]

1.2 鋅指核酸酶的作用原理

根據(jù)靶序列對兩個鋅指蛋白單體α螺旋上的3個可變氨基酸位點進行改造，獲得能高表達的鋅指蛋白。鋅指蛋白依靠其α螺旋上的3個可變氨基酸位點分別特異性地識別并結(jié)合兩側(cè)3′到5′方向的DNA靶序列，當兩側(cè)鋅指蛋白的靶位點反向排列并且間隔5～7 bp時，兩單體的Fok I核酸內(nèi)切酶二聚化，在靶位點切割造成雙鏈斷裂，從而激活細胞固有的DNA損傷修復機制(圖2)。該機制主要有兩種途徑，即非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(HR)。典型的NHEJ通常導致短基因在切割位點附近的插入或丟失，從而造成基因突變；然而在有外源DNA模板存在的情況下，一般會發(fā)生同源重組修復，HR修復會在切口處發(fā)生特定的基因的替換[5]。

圖2 ZFN作用原理示意圖[6]

1.3 鋅指核酸酶的應用

ZFN是第一種成功構(gòu)建的人工核酸酶。該技術(shù)經(jīng)過10多年的發(fā)展已經(jīng)頗有成果，模式生物-噬菌體、大腸桿菌、酵母、線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠、擬南芥，無疑成為該技術(shù)應用的首選實驗對象。如將ZFN mRNA注入斑馬魚單細胞期胚胎，將斑馬魚Ntl靶向敲除[7]；利用ZFN敲除小鼠Tbc1d，證明了該基因的損害會導致小鼠產(chǎn)生白內(nèi)障和睪丸異常[8]。同時，以ZFN技術(shù)為基礎(chǔ)的治療研究部分已經(jīng)進入臨床試驗階段，如糖尿病、神經(jīng)性疾病、AIDS和惡性腦膠質(zhì)瘤的治療[9]。

雖然ZFN技術(shù)在基因修飾上突變效率低、脫靶率高、對細胞有毒性，但其應用也不是完全沒有價值，近年來有研究者利用ZFN技術(shù)進行科研，并取得理想實驗效果。2014年Salabi F等[10]利用ZFN mRNA敲除綿羊的肌生成抑制蛋白(Myostatin, MSTN)單等位基因，觀察敲除該基因?qū)d羊早期衛(wèi)星細胞(Primary satellite cells, PSCs)增殖、分化的影響。利用ZFN技術(shù)對家畜進行基因修飾獲得轉(zhuǎn)基因家畜，尤其是家養(yǎng)豬，因為它與人類在遺傳學、解剖學和生理學方面的相似性，使得它越來越多地被作為模型應用在人類醫(yī)學上，如將豬用作異種器官移植、基礎(chǔ)研究和人類疾病模型的建立[11]。

2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)

2.1 TALEN的結(jié)構(gòu)

TALEN由TALE蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Fok I核酸內(nèi)切酶切割結(jié)構(gòu)域人工融合而成。TALE蛋白家族來自于黃單胞桿菌，TALE蛋白一般包含有4個部分：N端是具有分泌信號功能的易位結(jié)構(gòu)域(Translocation domain, TD)；中央?yún)^(qū)域是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；C端是核定位信號(Nuclear localization signal, NLS)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation domain, AD)。中央?yún)^(qū)域的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是識別靶序列的位點，一般包含有1～33個長度約為34個氨基酸殘基的串聯(lián)重復序列和C端一個由20個氨基酸殘基組成的半重復結(jié)構(gòu)域[12]。其中，每一個重復序列模塊中的第12和13位，稱之為重復可變雙氨基酸殘基位點(Repeat variable diresidues, RVD)，RVD高度可變的氨基酸殘基決定識別、結(jié)合DNA的特異性[13](圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物DNA識別密碼[13-14]

2.2 TALEN的作用原理

TALEN的結(jié)構(gòu)中提到識別靶序列的決定性因素是每個重復單元中的RVD，不同的RVD可以特異性地識別A、T、C、G 4種堿基的一種或多種，其中最常見的與4種堿基相對應的4種RVD分別是NI(Asn Ile)-A、NG(Asn Gly)-T、HD(His Asp)-C 和NN(Asn Asn)-G、A，這樣對靶序列的識別形成了對應的關(guān)系[14]。

TALEN能高效的發(fā)揮作用，除了RVD的改變外，TALEN靶位點的選擇也很重要。2011年，Bogdanove和Voytas對TALEN靶位點的選擇提出了幾條原則[15]：1)TALEN單體結(jié)合的5′端的靶位點的0位應是T；2)5′端靶位點的第一位不是T；3)5′端靶位點的第二位不是A；4)靶位點的3′端是T結(jié)尾；5)靶位點中的4種堿基組成有一定的比例。后來隨著高通量TALEN合成技術(shù)的發(fā)展，研究人員對TALEN的活性進行了大量的檢測和比較后發(fā)現(xiàn)，TALEN靶位點選擇只需要遵從：靶序列的5′端的0位置最好是核苷酸T[16]，這樣更利于研究人員利用TALEN來開展研究工作。

首先保證靶序列的5′端0位置是核苷酸T，其次根據(jù)前述4種堿基與RVD間的配對關(guān)系，針對靶位點的堿基組成，設計相對應的TALE重復序列，然后TALE重復序列中發(fā)揮識別作用的RVD識別并結(jié)合DNA鏈上的目標靶點，通常是每個重復序列對應一個堿基；隨后兩單體FokI發(fā)生二聚化后發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，使DNA產(chǎn)生一個雙鏈切口，從而引發(fā)機體自身的損傷修復機制-非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(HR)，見圖4。

圖4 TALEN靶向切割的原理示意圖[17]

2.3 TALEN的應用

TALEN蛋白首次報道被成功應用在酵母中[18]，之后TALEN技術(shù)又被成功應用在斑馬魚[19]、老鼠[20]及人類細胞[21]的基因組修飾上。在斑馬魚體細胞中靶向gria3a和hey2來檢測TALE核酸酶的活性[19]；利用TALEN突變大鼠的IgM[20]；利用TALEN技術(shù)對肌營養(yǎng)不良蛋白基因進行突變，誘導產(chǎn)生多功能干細胞(iPSC)來治療營養(yǎng)不良癥[21]。

其潛在的實際應用也在農(nóng)作物的改良[22]、家畜品型的改良以及人類疾病的治療方面得到了廣泛應用。如TALEN 靶向修飾人乳頭瘤病毒基因來改善與人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)相關(guān)的宮頸惡性腫瘤[23]。

3 常間回文重復序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9, CRISPR/Cas 9)

3.1 CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為細菌和古細菌的一種適應性免疫防御機制而被熟知，細菌和古細菌依靠此系統(tǒng)防御入侵的病毒和質(zhì)粒[24]，在消滅外來核酸同時，也將該外來核酸留在自身基因組中，當含有相同序列的外來核酸再次入侵時，機體能夠識別，并對其進行切割，達到自我保護的目的，類似于免疫記憶。近年來，該系統(tǒng)已被重新目的化成為RNA導向的DNA靶向修飾工具，它能夠產(chǎn)生RNA導向核酸酶，如Cas9快速高效的發(fā)揮修飾功能[25]，已在多種生物體中展現(xiàn)出了其作為基因組編輯工具的強大效力[26]，因而成為生物界的新寵。2013年以來，《Nature》、《Science》和《Cell》等國際頂尖雜志上刊登了許多CRISPR/Cas9相關(guān)論文。

CRISPR/Cas系統(tǒng)主要是由三個部分組成(圖5)，分別是5′端的trans-activating crRNA(tracrRNA)；中間是眾多Cas蛋白編碼基因，這是一個多態(tài)性家族基因，包含了Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，它們編碼的蛋白主要具有DNA解旋酶、核酸酶、聚合酶等活性；3′端的CRISPR基因座，CRISPR基因座由前導序列(Leader)和多個短而高度保守的同向重復序列(Repeat)和多個長度不等的間隔序列(Spacer)組成，其中前導序列一般位于CRISPR基因座上游，是富含AT的非編碼區(qū)域，重復序列一般長度為21～48 bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，各重復序列之間是間隔序列，長度為26～72 bp，是“俘獲”和識別外來DNA的關(guān)鍵位點。

3.2 CRISPR/Cas的作用原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)主要包含有3種類型[27]：TypeⅠ、Ⅱ、Ⅲ。Type Ⅰ分布在細菌和古細菌中，組分復雜；Type Ⅲ主要分布在古細菌中，在細菌中比較少見，因此這兩種類型被研究的較少；同時Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)由于組成相對簡單，只使用單效應酶，如Cas9來切割雙鏈DNA的獨特特點[28]而被廣泛應用于研究中。

在Ⅱ型系統(tǒng)中(圖5)，首先是新的間隔序列的獲得。外源核酸入侵時，Cas9蛋白通過前間區(qū)序列鄰近基序(Protospacer adjacent motifs, PAM)信號識別原間隔序列，然后酶切產(chǎn)生前體間隔序列，最后將其整合到CRISPR重復序列中，這個過程伴隨產(chǎn)生一個新的重復序列模塊。其次是crRNA(CRISPR-derived RNA)的表達、加工和成熟，從CRISPR位點上先轉(zhuǎn)錄得到pre-crRNA，在pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時，與其重復序列互補的tracrRNA也轉(zhuǎn)錄出來，并激活Cas9和雙鏈RNA特異性RNaseⅢ核酸酶對pre-crRNA進行加工，獲得成熟的crRNA，它由一個間隔序列和部分重復序列組成[29]。

圖5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和作用原理示意圖[33]

加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復合體，識別并結(jié)合與crRNA互補的序列，然后DNA雙鏈被解開，crRNA與互補鏈配對，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)。Cas9至少含有兩個活性位點，分別是氨基末端的類似于RuvC區(qū)域和蛋白質(zhì)中部的HNH(或McrA-like)核酸酶區(qū)域，對應剪切crRNA的互補DNA鏈和非互補鏈，因此當DNA雙鏈被解開后，由Cas9中的HNH活性位點剪切crRNA的互補DNA鏈，RuvC活性位點剪切非互補鏈[30]，最終引入DNA雙鏈斷裂(Double-strand break, DSB)。

Cas9切割的位點位于crRNA互補序列鄰近的PAM區(qū)。PAM通常臨近靶序列3′端，它能被Cas9蛋白的單個域識別，其典型的結(jié)構(gòu)組成是NGG，第一位可以是任何核苷酸，近來也有研究顯示，PAM位點是打開DNA鏈和靶向切割所必須的[30-31]。為進一步簡化操作過程，研究人員設計出了sgRNA(Single guide RNA)，它具有crRNA:tracerRNA復合物的功能，能夠引導Cas9蛋白識別并結(jié)合于靶位點[32]。

3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在模式生物中的應用：產(chǎn)膿鏈球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)被改造后，已經(jīng)被成功的應用在植物[34]、小鼠胚胎干細胞[35]、小鼠[28]、人類細胞系[26]的基因組定點修飾中，從而可以防止生物體內(nèi)有害基因的表達以及研究生物體內(nèi)某些未知基因的功能。如人細胞系中非編碼基因眾多，但其功能知道的很少，利用CRISPR/Cas9敲除人細胞系中的非編碼基因，如miR-21、miR-29a、lncRNA-21A等研究這些基因的功能[26]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在疾病治療中的應用：乳頭瘤病毒16(Human papillomavirus 16, HPV16)被認為是人子宮頸癌發(fā)生的主要原因，一旦被HPV感染后，其中主要的腫瘤蛋白E6就會破壞宿主的腫瘤抑制蛋白p53，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)破壞HPV16的E6基因來治療由HPV感染引起的惡性子宮頸瘤[36]。利用Cas9/gRNA編輯HIV-1的LTR U3結(jié)構(gòu)域，從而抑制HIV病毒基因在其潛伏的神經(jīng)膠質(zhì)細胞、T細胞里的表達和復制[37]。Peng[38]等研究表明，與RNAi干擾相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在功能丟失和獲得方面都具有更高的效率和可靠性，因此利用CRISPR/Cas9將Livin(又稱Melanoma inhibitor of apoptosisprotein/Kidney inhibitor of apoptosisprotein, ML-IAP/KIAP)敲除對治療胃癌的臨床效果更好。

CRISPR/Cas9在家畜育種中的應用：從克隆羊“多利”出生后，動物體上對轉(zhuǎn)基因的應用可謂是產(chǎn)生了大的突破，但轉(zhuǎn)基因育種由于其表達的可控性差、較難獲得穩(wěn)定的表型、生物安全性評估困難等缺點，其進展較緩慢，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)對基因組定點修飾的高效性，使得其在家畜育種中有廣闊的應用前景。

表1 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)特點的比較

4 小結(jié)

ZFN作為基因靶向修飾的第一代產(chǎn)物，存在的問題主要集中在兩個方面，一是組裝、篩選出高特異性的鋅指蛋白，而這個過程復雜，且不易找到合適的識別位點(大概每500 bp才有一個潛在的靶位點)；二是FokI核酸內(nèi)切酶的非特異性，會對非靶點進行切割，對細胞產(chǎn)生毒性。ZFN的不足促使研究者找到更完善的技術(shù)，隨之產(chǎn)生了TALEN技術(shù)，TALEN具有比ZFN高的突變效率和低的脫靶現(xiàn)象，TALEN由于識別序列更長些，因此脫靶效率低，但這只是相對而言，TALEN的突變率和脫靶現(xiàn)象仍是需要解決的問題。

相比ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9技術(shù)切割DNA的效率更高，研究人員利用TALEN和CRISPR/Cas9兩種技術(shù)將同一細胞的相同基因位點進行基因編輯后發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9的基因編輯效率要比TALEN高出大約10倍。在質(zhì)粒構(gòu)建上，CRISPR/Cas9技術(shù)具有設計簡單、操作簡便、成本低廉的優(yōu)勢。CRISPR/Cas9系統(tǒng)設計過程中，只需將靶基因sgRNA中由20個堿基組成的向?qū)蛄屑右愿淖兗纯?，這個操作由一步簡單的分子克隆就能完成。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)特點的比較見(表1)。

CRISPR/Cas9由于其可靠、高效、快速的優(yōu)點成為基因組靶向修飾的新寵，已被廣泛應用，但該技術(shù)也存在應用難點：一是需要根據(jù)實驗要求和sgRNA設計原則，設計出能具有較高特異性的sgRNA，并在后面的活性檢測中具有較高的活性；二是Cas9的脫靶現(xiàn)象，雖研究證明并不存在脫靶現(xiàn)象，但不同物種間的差異并不能確切說明是否存在此現(xiàn)象；三是Cas9是細菌蛋白，它的表達是否會產(chǎn)生毒性也是有待于解決的問題。

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Research progress on the targeted genome modification

ZHOU Yang1, YUAN Shao-fei1, JIANG Ting-ya1,HANG Bang-xing2, GAO Li1, CHEN Nai-fu2

(1. Institute of Life Sciences, Jiangsu University, Zhenjiang 212013; 2. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Engineering Technology Research Center of Research and Development of Traditional Chinese Medicine, Lu'an 237012, China)

Targeted genome modification technology is one of the important methods to study genes′ function, which also can be used for the treatment of human diseases at the same time. It is becoming a hot field of biology research in recent years. Because of its low efficiency and toxicity, traditional targeted modification technology will be replaced by a more efficient and safer technology. Thus three generations of targeted genome modification technologies have been developed. It includes ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9. These three techniques overcome the defects of traditional technology. Here, we discuss the research progress in the structure, mechanism and application of these three technologies, especially newly developed CRISPR/Cas9. Finally, the three generations of genome modification techniques are compared.

targeted genome modification; ZFN; TALEN; CRISPR/Cas9

2000-00-00；

2000-00-00

國家自然科學基金(31301919)；江蘇省自然科學基金(BK20130506)；安徽省自然科學基金(1508085MH203)；安徽省高等學校省級自然科學基金項目(KJ2011A270、KJ2013A265)和江蘇大學高級人才科研啟動基金(1281330018)

周 陽，男，博士，助理研究員，主要從事神經(jīng)退行性病變及金屬離子的代謝，E-mail：zhouyang@ujs.edu.cn；

陳乃富，男，教授，碩士生導師，研究方向為生物資源開發(fā)與利用，E-mail：cnf505@126.com

Q78

A

2095-1736(2015)05-0070-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.070