史應(yīng)學(xué), 王　迪, 竺俊全 , 吳雄飛

(1. 寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211;2. 寧波市海洋與漁業(yè)研究院, 寧波 315012)

中國花鱸精子超低溫冷凍前后的活力及酶活性比較

史應(yīng)學(xué)1, 王迪1, 竺俊全1, 吳雄飛2

(1. 寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211;2. 寧波市海洋與漁業(yè)研究院, 寧波 315012)

以Cortland液為稀釋液、10%EG為抗凍劑、0.25 mL麥細(xì)管為凍存管，兩步降溫法超低溫冷凍中國花鱸精子，對冷凍前后精子活力及6種酶活性變化進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，凍存15 d與30 d的凍精激活率及運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別為(86.67±3.79)%及(15.08±0.72)min、(86.00±3.61)%及(14.83±1.23)min，與鮮精激活率(92.67±2.52)%及運(yùn)動(dòng)時(shí)間(15.75±1.25)min相比無顯著差異。凍存15 d與30 d的凍精總ATP 酶、SDH、LDH、SOD、CAT和GR活性分別為：(73.09±3.94)U/mL與(71.57±5.51)U/mL、(44.67±4.93)U/mL與(43.67±4.93)U/mL、(6916.93±265.45)U/L與(6889.73±262.63)U/L、(84.80±4.08)U/mL與(84.42±3.09)U/mL、(92.37±7.64)U/mL與(92.13±7.37)U/mL、(79.01±3.93)U/L與(75.91±2.95)U/L，與鮮精酶活性相比差異不顯著。認(rèn)為以Cortland液為稀釋液、10%EG為抗凍劑、兩步降溫法超低溫冷凍中國花鱸精子的效果較好。

中國花鱸; 精子; 活力; 超低溫冷凍; 酶活性

中國花鱸(Lateolabraxmaculatus)又名鱸魚，屬鱸形目、鮨科、花鱸屬，為中國沿海重要經(jīng)濟(jì)魚類及增養(yǎng)殖種之一，也是出口創(chuàng)匯水產(chǎn)品種。由于歷年過度捕撈及環(huán)境污染等因素，其自然資源衰退，養(yǎng)殖品種也因近親繁殖出現(xiàn)種質(zhì)退化現(xiàn)象。精子超低溫冷凍保存是種質(zhì)保存的有效措施之一，在育種及育苗生產(chǎn)上具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。以往，有關(guān)中國花鱸精子的超低溫冷凍保存研究已見報(bào)道，主要涉及抗凍液、稀釋比、冷凍及解凍方法等方面[1-2]，尚未見超低溫冷凍對中國花鱸精子酶活性影響方面的研究報(bào)道。精子酶活性，如ATP酶、SDH(琥珀酸脫氫酶)、LDH(乳酸脫氫酶)及SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(過氧化氫酶)、GR(谷胱甘肽還原酶)活性與精子活力密切相關(guān)[3-8]；超低溫冷凍、解凍過程對精子造成的機(jī)械損傷及膜蛋白從細(xì)胞膜中分離所造成的細(xì)胞膜腫脹、畸形及翻轉(zhuǎn)等變化，導(dǎo)致酶類物質(zhì)溢出[9]；對冷凍精子的酶活性進(jìn)行檢測，可為精子質(zhì)量的評價(jià)提供依據(jù)[8-16]。本研究以Cortland液為稀釋液、10%EG為抗凍劑、0.25 mL麥細(xì)管為凍存管，兩步降溫法超低溫冷凍中國花鱸精子，對冷凍前后精子活力及6種酶活性變化進(jìn)行了測定分析，旨在補(bǔ)充中國花鱸精子超低溫冷凍保存技術(shù)資料。

1　材料和方法

1.1材料

性成熟中國花鱸雄魚于2013年11月23日取自浙江省奉化市石沿育苗廠，魚體重3.0～4.0 kg/尾，共10尾，經(jīng)促黃體素釋放激素類似物和絨毛膜促性腺激素(LRH-A +HCG)催產(chǎn)，暫養(yǎng)于水溫為14℃～15℃的水泥池中，30 h后采精。

1.2方法

1.2.1精液的采集用魚夾夾住魚，用干毛巾擦去生殖孔周圍及體表的水分，輕壓魚腹使精液自然流出，用潔凈的注射器將精液移入離心管中，置于冰浴上(4℃)備用。

1.2.2精子的超低溫冷凍及解凍 將精液稀釋液即Cortland液(NaCl 7.25 g/L，NaHCO31.00 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.41 g/L，KCl 0.38 g/L，CaCl20.18 g/L，MgSO4·7H2O 0.23 g/L，C6H12O61.00 g/L，pH值為7.00)與10%EG(乙二醇，終濃度)混合配制成抗凍液，置于冰箱(4℃)預(yù)冷；將采得的精液與抗凍液按1∶3比例混勻，4℃平衡30 min；將平衡后的精液-抗凍液混合物分裝入0.25 mL麥細(xì)管中，然后用兩步降溫法(即將盛精麥細(xì)管平放在自制簡易降溫裝置的液氮面上7.5 cm處，停留10 min后投入液氮中)保存。超低溫冷凍15 d和30 d后，將麥細(xì)管從液氮中快速取出，于40℃水浴中溶化后進(jìn)行精子活力與酶活性檢測。

1.2.3精子活力測定 以過濾海水(水溫15℃、pH值8.1、鹽度27)為激活液，將鮮精和凍精分別與激活液混合后在顯微鏡下觀察精子活力(激活率、活動(dòng)時(shí)間和壽命)。激活率為給定視野中被激活精子的數(shù)量占全部精子數(shù)量的百分比；運(yùn)動(dòng)時(shí)間是指精子自激活開始至90%的精子原地顫動(dòng)為止所經(jīng)歷的時(shí)間；精子的壽命指精子從激活開始至90%的精子停止運(yùn)動(dòng)的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4酶活性檢測方法按章龍珍等[8]的方法處理鮮精和凍精樣本。用購自南京建成生物工程研究所的酶活檢測試劑盒測定總ATP酶、SDH、LDH及SOD、CAT、GR活性，實(shí)驗(yàn)操作參照各說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)各組酶活性、精子活力的差異顯著性，差異顯著水平為P<0.05。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果

2.1中國花鱸鮮精與凍精的活力

鮮精及超低溫冷凍15 d和30 d后解凍的中國花鱸精子活力測定結(jié)果見表1。統(tǒng)計(jì)分析表明，鮮精與凍精的活力相比差異不顯著。

表1 中國花鱸鮮精與凍精的活力

D0—鮮精; D1—冷凍15 d的凍精; D2—冷凍30 d的凍精; 表中同列數(shù)據(jù)上方標(biāo)注的字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2 中國花鱸鮮精與凍精的酶活性

圖1 中國花鱸鮮精與凍精的總ATP酶活性

圖2 中國花鱸鮮精與凍精的SDH活性

從圖1可見，中國花鱸鮮精、超低溫冷凍保存15 d及30 d后的凍精總ATP酶活性分別為(80.13±3.21)U/mL、(73.09±3.94)U/mL及(71.57±5.51)U/mL，三者之間無顯著差異。

圖3 中國花鱸鮮精與凍精的LDH活性

從圖2可知，中國花鱸鮮精SDH活性為(52.00±2.65)U/mL，經(jīng)超低溫冷凍15 d后，SDH活性降為(44.67±4.93)U/mL，30 d后SDH活性降至(43.67±4.93)U/mL，三者之間無顯著差異。

圖4 中國花鱸鮮精與凍精的SOD活性

由圖3可見，中國花鱸鮮精LDH活性為(7342.00±147.53)U/L，經(jīng)超低溫冷凍15 d后LDH活性降為(6916.93±265.45)U/L，30 d后降至(6889.73±262.63)U/L，三者之間差異不顯著。

由圖4可見，中國花鱸鮮精SOD活性為(90.42±2.83)U/mL，經(jīng)超低溫冷凍15 d后SOD活性降為(84.80±4.08)U/mL，30 d后降至(84.42±3.09)U/mL，三者之間無顯著差異。

圖5 中國花鱸鮮精與凍精的CAT活性

圖6 中國花鱸鮮精與凍精的GR活性

由圖5可知，中國花鱸鮮精內(nèi)CAT活性為(108.74±11.37)U/mL，經(jīng)超低溫冷凍15 d后CAT活性降為(92.37±7.64)U/mL，30 d后降至(92.13±7.37)U/mL，三者之間無顯著差異。

從圖6可見，中國花鱸精子內(nèi)GR活性隨冷凍時(shí)間的延長，活性先上升而后下降。中國花鱸鮮精內(nèi)GR活性為(73.82±3.37)U/L，經(jīng)超低溫冷凍15 d后，GR活性升到(79.01±3.93)U/L，30 d后GR活性為(75.91±2.95)U/L，三者之間差異不顯著。

3　討論

ATP酶通過催化ATP水解產(chǎn)生ADP及無機(jī)磷釋放能量以維持生命體的各種生命活動(dòng)，ATP含量受ATP酶活性影響。SDH是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體內(nèi)膜上，其活性在一定程度上反映了精子線粒體的功能[11]。精子經(jīng)超低溫冷凍后，線粒體會(huì)出現(xiàn)脫落、移位及腫脹、膜破裂等損傷，這些損傷將導(dǎo)致SDH活性發(fā)生變化[9,17-18]。LDH是一種糖酵解酶，在體內(nèi)能量代謝、精子發(fā)生及受精過程中起重要作用，精子的LDH活性可作為精液質(zhì)量檢測的指標(biāo)[12]。有研究表明，ATP酶、SDH及LDH活性與精子活力相關(guān)[3-5]。黃曉榮等[14-15]對長鰭籃子魚(Siganuscanaliculatus)精子和日本鰻鱺(Anguillajaponica)精子超低溫冷凍后發(fā)現(xiàn)，精子總ATP酶、SDH活性顯著下降、活力明顯降低；閆秀明等[9]對黃鱔(Monopterusalbus)精子超低溫冷凍后發(fā)現(xiàn)，精子LDH活性明顯下降、活力顯著降低。Babiak等[16]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，虹鱒(Oncorhynchusmykiss)精子在超低溫冷凍后LDH活性顯著下降、活力明顯受影響。本研究，超低溫冷凍15 d、30 d的中國花鱸精子與鮮精相比，總ATP酶、SDH、LDH活性及精子活力未見明顯變化。

精子在超低溫冷凍過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧是自由基的重要組成部分，過多的自由基如不能被及時(shí)清除，精子會(huì)遭受脂質(zhì)過氧化等損傷，導(dǎo)致活力降低[6,8,19]。SOD是以自由基為底物的酶，能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免遭損傷，對機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起至關(guān)重要的作用；CAT又稱為觸酶，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，可促使H2O2分解為水和氧，從而保護(hù)細(xì)胞免遭H2O2的損害；GR是一種黃素酶，可通過催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH )來維持細(xì)胞膜的完整性。有研究表明，SOD、CAT及GR活性與精子活力密切相關(guān)[6-8]。黃曉蓉等[14-15]發(fā)現(xiàn)，長鰭籃子魚精子和日本鰻鱺精子在超低溫冷凍后GR活性顯著上升，SOD、CAT活性顯著下降，精子活力明顯降低；章龍珍等[8]發(fā)現(xiàn)，俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedti)精子在超低溫冷凍后SOD、CAT、GR活性及精子活力也有相似變化。本研究，超低溫冷凍15 d、30 d的中國花鱸精子與鮮精相比，SOD、CAT、GR活性及精子活力變化不明顯。

在冷凍、解凍過程中，精子內(nèi)冰晶的形成和消失及精子外滲透壓改變引起的擠壓作用，會(huì)對精子造成一定的機(jī)械損傷，同時(shí)，精子膜蛋白因從細(xì)胞結(jié)構(gòu)中分離會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生腫脹、畸形及翻轉(zhuǎn)等變化[9,18]。各種損傷將導(dǎo)致酶類物質(zhì)從精子內(nèi)溢出，另外，低溫冷凍對酶類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)也會(huì)造成一定程度的損害，從而降低了精子的酶活性。但精子在凍存及解凍條件適宜的情況下，結(jié)構(gòu)不易損傷，酶活性能得到較好保護(hù)。本研究中，超低溫冷凍保存30 d內(nèi)的中國花鱸精子能量代謝酶和抗氧化酶與鮮精相比差異不顯著，說明精子凍存條件較適宜，酶活性保護(hù)較好。

一般認(rèn)為，精子在超低溫冷凍保存條件下處于休眠狀態(tài)，保存時(shí)間長短對精子質(zhì)量無顯著影響[20]。Suquet等[21]研究發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍保存9個(gè)月的大菱鲆(Psettamaxima)精子，受精率、活力與鮮精相比無顯著差異；Ding等[22]研究發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍保存1周和1年的鱖魚(Sinipercachuatsi)精子，受精率、孵化率與鮮精相比差異不明顯；陳亞坤等[20]研究發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍保存1、13和26個(gè)月的真鯛(Pagrusmajor)精子，激活率和受精率沒有顯著變化，但在冷凍保存48個(gè)月，激活率和受精率則顯著降低。本研究中，超低溫冷凍30 d內(nèi)的中國花鱸精子活力及6種酶活性沒有顯著變化。

綜上所述，以Cortland液為稀釋液、10%EG為抗凍劑、兩步降溫法超低溫冷凍30 d內(nèi)的中國花鱸精子，其內(nèi)能量代謝酶和抗氧化酶受到了較好保護(hù)，精子活力較高。

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Motility and enzyme activities of fresh and cryopreservated sperm inLateolabraxmaculatus

SHI Ying-xue1, WANG Di1, ZHU Jun-quan1, WU Xiong-fei2

(1. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University,Ningbo 315211; 2. Ningbo Academy of Oceanology and Fisheries, Ningbo 315012, China)

In order to investigate damage mechanism of sperm after cryopreservation(-196℃), we used 10%EG(ethylene glycol) as cryoprotectant, Cortland as extender, and two-step cooling procedure to cryopreserveLateolabraxmaculatussperm in 0.25 mL straws. The motility of fresh sperm and frozen-thawed sperm was detected by microscopy and the enzyme activities by reagent kits. The results showed that there were no significant differences between fresh sperm and frozen-thawed sperm of freezing for 15 d or 30 d in motility. The activation rate, moving time and life-span of fresh sperm were (92.67±2.52)%, (15.75±1.25)min and (20.67±1.76)min, and (86.67±3.79)%, (15.08±0.72)min and (19.83±1.44)min of frozen-thawed sperm for freezing 15 d, and (86.00±3.61)%, (14.83±1.23)min and (19.67±0.52)min of freezing for 30 d. The activities of total ATPase, SDH, LDH, SOD, CAT and GR of frozen-thawed sperm after cryopreservation for 15 d and 30 were (73.09±3.94)U/mL, (44.67±4.93)U/mL, (6916.93±265.45)U/L, (84.80±4.08)U/mL, (92.37±7.64)U/mL, (79.01±3.93)U/L and (71.57±5.51)U/mL, (43.67±4.93)U/mL, (6889.73±262.63)U/L, (84.42±3.09)U/mL, (92.13±7.37)U/mL, (75.91±2.95)U/L, respectively. In addition to GR, the other enzyme activities all decreased with the freezing time prolonged. Enzyme activities detection showed that there was no significant difference between fresh sperm and frozen-thawed sperm inLateolabraxmaculatus. So we concluded that cryopreservation had no significant effects on the enzyme activities and motility of sperm inLateolabraxmaculatususing the previous procedure.

Lateolabraxmaculatus; sperm; motility; cryopreservation; enzyme activities

2015-01-14；

2015-02-11

寧波市科技計(jì)劃重大項(xiàng)目(2015C110005);國家海洋局海洋藥源生物種質(zhì)資源庫建設(shè)項(xiàng)目(12PYY001SF08-NBDX-1)；浙江省水產(chǎn)新品種選育專項(xiàng)(2012C12907-8)

史應(yīng)學(xué)，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail: ahsyxue@163.com；

竺俊全，教授，主要從事水產(chǎn)生物學(xué)研究，E-mail: zhujunquan@nbu.edu.cn。

S965.211；S917.4

A

2095-1736(2015)05-0048-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.048