(1. 云南師范大學生命科學學院 云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應進化及保護重點實驗室 昆明 650500； 2. 大理州巍山縣第二中學， 巍山 672401)

云南劍川地區(qū)大絨鼠線粒體細胞色素b和控制區(qū)遺傳多樣性的研究

沐 遠1， 楊 濤1， 馬壯瓊2， 張 浩1， 朱萬龍1， 王政昆1

(1. 云南師范大學生命科學學院 云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應進化及保護重點實驗室 昆明 650500； 2. 大理州巍山縣第二中學， 巍山 672401)

通過對云南劍川30個大絨鼠樣本線粒體細胞色素b基因(Cytb)和控制區(qū)(D-loop)序列研究，初步探討劍川大絨鼠的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)生。結果表明，劍川地區(qū)大絨鼠Cytb包含16個變異位點(占全序列的1.40%)，其中轉換3個，顛換0個，核苷酸多樣性(Pi)為0.00269，單倍型多態(tài)度(Hd)0.876±0.041，共定義12個單倍型。D-loop全長987 bp，包含28個變異位點(占全序列的2.84%)，其中轉換5個，顛換1個，Pi為0.0055，Hd為0.924±0.029，共定義16個單倍型。Cytb和D-loop單倍型系統(tǒng)樹顯示，30個樣本形成兩支，且D-loop序列中顯示出的多樣性水平可推測其種群比Clethrionomys種群更年輕。其基因的多樣性水平可能與其分布范圍和生態(tài)因子有關。

生態(tài)學；大絨鼠；遺傳多樣性

絨鼠屬(Rodentia, Cricetidae, Microtinae,Eothenomys)主要分布于中國的橫斷山及其附近地區(qū)[1]，屬于田鼠亞科(Arvicolinae)動物。橫斷山地區(qū)位于南亞次大陸與歐亞大陸鑲嵌交接帶東翼，為中國環(huán)太平洋帶與西部古地中海帶間的過渡地帶[2]。第四紀以來，由于冰川活動和云貴高原隆起，導致該地區(qū)氣候特征由濕潤、溫暖向干燥、寒冷演化，且該地區(qū)氣候年溫差小，日溫差大[3]。絨鼠化石在橫斷山發(fā)現(xiàn)至今，有關于該類物種大規(guī)模擴散和遷移的報道甚少[4]。對田鼠亞科動物研究有利于對第四紀原始氣候和環(huán)境的了解[5]，此外，冰期與間冰期的多次交替出現(xiàn)，對物種多樣性的產生造成了巨大的影響[6]。

動物線粒體DNA(mtDNA)分子小而穩(wěn)定、母系遺傳、進化速度快等特征，已成為進化生物學，保護生物學和遺傳多樣性分析研究的一個強有力的工具[7]。其分為非編碼區(qū)和編碼區(qū)兩個部分，非編碼區(qū)就是線粒體基因的控制區(qū)(即D-loop)，編碼區(qū)編碼包括tRNAs，rRNAs，疏水性蛋白質多態(tài)，細胞色素b(Cytb)，ATP酶的亞單位，細胞色素c(Cytc)，氧化酶的亞單位(COI、COII、COIII)，NADP還原酶復合體的亞單位等[8]。哺乳動物線粒體基因的進化速率遠遠高于單拷貝核基因，可達單拷貝基因的5～10倍，因此適合于做群體遺傳學分析的分子標記[9]。為了進一步提供更多有關于絨鼠的群體遺傳信息，本研究對云南劍川地區(qū)大絨鼠Cytb和D-loop的遺傳多樣性進行檢測，為該地區(qū)大絨鼠乃至絨鼠屬的分類及多樣性提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的30只大絨鼠(Eothenomysmiletus)均捕自云南省劍川石龍村(北緯25°25′～26°22′，東經102°13′～102°57′)附近的灌叢及農田(海拔1679 m)。

1.2 實驗方法

1.2.1 mtDNA提取參見朱萬龍等[10]。

1.2.2 引物設計及PCR 擴增

1)CytbPCR引物采用Irwin等報道的哺乳動物Cytb通用引物[11]。

PCR反應體系建立參見朱萬龍等[10]。擴增循環(huán)設置如下：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。

2)D-loopPCR引物根據(jù)謝建云等東方田鼠引物[12]，修改為：

KZ-F：5′-acttaaattactctggtcttgtaacct-3′

KZ-R：5′-ataaatttaaaggccaggaccaaaacc-3′

引物覆蓋段基因長度為1 073 bp。

PCR反應體系建立參見朱萬龍等[10]。擴增循環(huán)設置如下：94℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.2.3 PCR產物的純化和測序

PCR 產物用0.8 %的瓊脂糖電泳檢測，在凝膠成像儀觀察，割下亮帶。將割下的膠用Glassmilk DNA 純化回收試劑盒(博大泰克生物基因技術有限責任公司的產品)進行純化回收，回收產物送大連寶生物工程有限公司測序(測序使用試劑：BigDye Terminatort v3.1 Cycle Sequencing Kit；測序儀器：ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer；ABI PRISMTM 377XL DNA Sequencer)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

序列用Clustalx軟件分析比對，用MEGA(version 3.10)中的Kimura雙參數(shù)法計算各單倍型間的遺傳距離。利用DNASP (version 4. 0)統(tǒng)計單倍型及變異位點、計算單倍型多樣性(Hd)及核苷酸多樣性(Pi)[13]。采用MEGA 3.1鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)、最小進化(Minimum Evolution, ME)和最簡約法(Maximum Parsimony, MP)對30個樣本中單倍型的樣本構建系統(tǒng)樹[14]。系統(tǒng)樹各分支的自舉檢驗值(Bootstrap)由1 000次重復檢驗。

圖 1 NJ、ME和MP方法構建劍川地區(qū)絨鼠Cyt b單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹

每支上面的數(shù)字表示基于1 000 次重復的不同方法的自舉檢驗置信度。下同。

2 結果

2.1Cytb核苷酸組成及多樣性參數(shù)

30只絨鼠Cytb序列(1 140 bp)中，A、T、C和G的比例分別為29.8%、26.3%、30.6%和13.3%，A+T含量明顯高于G+C含量。其中，共發(fā)現(xiàn)16個變異位點，占分析位點數(shù)的1.40%，包括3個轉換(transition, Ts) (第1位點2個；第3位點1個)和0個顛換(transversion, Tv)位點，簡約信息位點(parsimonious informative site)11個，占全序列的0.96%。

表1 12個單倍型個體Cyt b基因序列的Kimura雙參數(shù)模型的遺傳距離

多態(tài)位點數(shù)(S)為16，核苷酸多樣性(Pi)為0.002 69，平均核苷酸差異數(shù)(K)為3.069。30條Cytb序列中，單倍型12個，單倍型多態(tài)度(Hd)為0.876，Hd標準誤為0.041。對12個單倍型構建系統(tǒng)樹，其中主要分為兩支(圖1)。Kimura雙參數(shù)法(Kimura, 1980)計算的12個單倍型間的遺傳距離在0.001～0.007(表1)。

2.2D-loop核苷酸組成及多樣性參數(shù)

D-loop序列(1 073 bp)中，tRNA Pro與tRNA Phe之間所包含的D-loop序列長987 bp。987 bp中A、T、C和G的比例分別為29.7%、29.4%、27.4%和13.5%，A+T含量明顯高于G+C含量，核苷酸偏向性較Cytb明顯。28個變異位點(占分析位點數(shù)的2.84%)中包括5個轉換(第1位點1個，第2位點和第3位點分別兩個)和1個顛換位點(第3位點)，簡約信息位點(parsimonious informative site)20個，占2.03%。Ts/Tv為9.4。

其中ETAS區(qū)有4個轉換，沒有顛換，Ts/Tv為15.5，18個變異位點，占分析位點數(shù)的7.11%；CSB區(qū)不存在轉換和顛換，差異由缺失產生，1個簡約信息位點，2個變異位點，占分析位點數(shù)的1.90%。Central區(qū)域中也沒有轉換和顛換，1個簡約信息位點，1個變異位點，占分析位點數(shù)的3.1%。D-loop多態(tài)位點數(shù)S為28，Pi為0.0055，K為5.901。30條D-loop序列共檢測到16個單倍型。Hd為0.924，Hd標準誤0.029。對16個單倍型構建系統(tǒng)樹，其中主要分為兩支(圖2)。16個單倍型個體間Kimura雙參數(shù)法計算的遺傳距離在0.001～ 0.015(表2)。

圖 2 NJ、ME和MP方法構建劍川地區(qū)絨鼠D-loop單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹

D1D2D3D4D7D9D12D13D14D17D18D19D21D25D27D29D1D20．014D30．0030．011D40．0020．0140．003D70．0010．0130．0020．001D90．020．0140．0030．0020．001D120．0020．0140．0030．0020．0010．002D130．0090．0080．0070．0090．0080．0090．009D140．0040．0140．0050．0040．0030．0040．0040．011D170．0050．0130．0020．0030．0040．0050．0050．0070．007D180．0060．0120．0030．0060．0050．0060．0060．0080．0060．005D190．0090．0100．0070．0090．0080．0090．0090．0020．0110．0070．008D210．0040．0140．0050．0040．0030．0020．0040．0110．0060．0070．0080．011D250．0030．0150．0040．0030．0020．0030．0030．0100．0050．0060．0070．0100．005D270．0020．0120．0010．0020．0010．0020．0020．0080．0040．0030．0040．0080．0040．003D290．0020．0140．0030．0020．0010．0020．0020．0090．0040．0050．0060．0090．0040．0030．002

3 討論

3.1Cytb多樣性

mtDNA中Cytb基因是線粒體呼吸鏈上的一個亞單位，其進化速率適中，一個較小的基因片斷就包含著種內到種間乃至科間遺傳進化信息，常常被用作研究系統(tǒng)進化、種屬間分類的分子標記[15]。劍川石龍30個大絨鼠的Cytb(1 140 bp)中，轉換3個，沒有顛換位點。哺乳動物的mtDNA堿基替換中存在轉換偏倚性(Bias)，即隨著進化時間增加，顛換會逐漸地積累，而轉換偏倚性會下降[16]，因此我們認為此基因序列的突變仍未達到飽和狀態(tài)，隨著時間的推移，遺傳差異的增加，轉換將趨于飽和。對于Cytb而言，DNA水平上受自然選擇壓力的影響，密碼子第3位點的突變率高于第1和第2位點。然而第3位點絕大多數(shù)是同義突變，受自然選擇壓力小遠遠小于第1、第2位點，突變后易被固定[17]。該地區(qū)絨鼠Cytb基因中3個轉換兩個發(fā)生在第一位點，一個發(fā)生在第3位點，因此自然選擇可能對該物種壓力較大。

核苷酸多樣性(Pi)是檢測遺傳多樣性的重要指標，Pi的高低與物種的適應能力、生存能力和進化潛力密切相關[18]。據(jù)Neigel報道，同種哺乳動物不同的個體之間平均核苷酸順序歧異值都存在有較大的差異，一般在0.3%到4%之間，最大的竟達10%以上[19]。我們的研究表明，劍川地區(qū)大絨鼠Cytb的Pi與其它小型哺乳動物相比偏低(表3)，這可能是其遷移能力及分布較窄相關。

表3 不同物種mtDNACytb核苷酸多樣性

Table 3 Nucleotide diversity at the mtDNACytbamong different species

物種Species種名Name核苷酸多樣性Nucleotidediversity參考文獻Reference大絨鼠E．miletus0．00269本研究荒漠偽鼠Pseudomysdesertor0．102～0．136Alpersetal．，2003[20]長爪沙鼠Merionesunguiculatus0．022～0．999梁 君等，2007[21]大沙鼠Rhombomysopimus0．00222～0．00665寧恕龍等，2007[22]中緬樹鼩Tupaiabelangeri0．00455～0．00523朱萬龍等，2014[10]高山姬鼠Apodemuschevrieri0．001741～0．006433朱萬龍等，2013[23]高原屬兔Ochotonacurzoniae0．0248葛艷麗等，2009[24]鼢鼠Eospalax0．08786楊紅善等，2007[25]睡鼠Glisglis0．06Naderietal．，2014[26]

3.2D-loop多樣性

D-loop為不編碼基因，富含AT堿基，其DNA序列的進化速度在mtDNA中最快，是群體遺傳研究中最佳的分子標記，適合做不同群體遺傳變異的研究。劍川地區(qū)30只大絨鼠tRNA Pro與tRNA Phe間包含987 bp的D-loop序列。且基因結構與其它鼠類的D-loop一致[27]。D-loop的長度會因物種的不同而不同：如C.Rufocanus970～971 bp；C.Glareolus945～946 bp；C.Gapperi945～947 bp；C.Californicus943～944 bp；C.Rutilus942～944 bp[28]。該地區(qū)大絨鼠的D-loop長987 bp，明顯的長于Clethrionomys。

987 bpD-loop中，A、T、C和G比例分別為29.7%、29.4%、27.4%和13.5%，A+T含量明顯高于G+C含量，這與其它鼠類相似[29]。28個變異位點，占總位點的2.84%，明顯高于Cytb，這主要由于D-loop富含AT堿基，因此比線粒體基因其它區(qū)域突變更高[30]。28個變異位點中，5個轉換和1個顛換，Ts/Tv為9.4。在物種水平上，該區(qū)段會傾向于轉換，如Rattus[29]和Clethrionomys[28]。ETAS區(qū)有4個轉換，沒有顛換，Ts/Tv為15.5，18個變異位點，占總位點的7.11%；CSB區(qū)域沒有轉換及顛換，存在的差異由缺失產生，變異位點2個，占總位點的1.90%。Central區(qū)域中沒有轉換和顛換，1個變異位點，占總位點的3.1%。該地區(qū)大絨鼠D-loop的基因突變，與Clethrionomys報道的相似[28]，但與Rattus不同[29]。

就目前的化石資料[31]、形態(tài)及染色體核型[32]而言，尚不能判定絨鼠和Clethrionomys的整個起源、進化及擴散。該地區(qū)大絨鼠Pi為0.0055，K為5.901。30條D-loop序列檢測到16個單倍型，Hd為0.924±0.029。該地區(qū)大絨鼠D-loop的多樣性少于Clethrionomys中的C.glareolus、C.gapperi和C.rutilus[28]。根據(jù)中性理論，在基因多樣性水平上，較古老的物種將比年輕的物種具有更高的多樣性，由此推測該地區(qū)大絨鼠比C.glareolus、C.gapperi和C.rutilus種群更年輕。此外，基因可變的分布不是隨機發(fā)生的，它與物種生存的環(huán)境密切相關，可以解釋物種對生態(tài)因子的適應結果。Reyes研究表明，鼴形鼠D-loop多樣性的變化與其生存環(huán)境中干旱和溫度的壓力有重要關聯(lián)[33]。第四紀以來，由于冰川活動和云貴高原提升，導致橫斷山地區(qū)氣候特征發(fā)生劇烈變化[3]，因此在外界環(huán)境強烈干擾下，物種多樣性乃至生物多樣性也隨之發(fā)生變化。在種群擴散過程中，多樣性水平受到多種環(huán)境因子的影響，可能隨著降雨和季節(jié)性的差異而發(fā)生變化[28]。因此，這也可能是導致劍川地區(qū)大絨鼠D-loop多樣性少于Clethrionomys的原因之一。

總之，云南劍川地區(qū)大絨鼠Cytb和D-loop都顯示出其多樣性相對較小。從D-loop序列中顯示出的多樣性水平推測，該地區(qū)大絨鼠種群比Clethrionomys種群更年輕。此結果為進一步研究田鼠亞科動物(Eothenomys、Clethrionomys、Alticola以及Caryomys等各屬間)的演化關系提供了一定的分子遺傳學基礎。該地區(qū)大絨鼠基因的多樣性水平可能與其分布范圍和所處生態(tài)因子有關。

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Genetic diversity of mitochondrial cytochromeband control region inEothenomysmiletusof Jianchuan, Yunnan Province

MU Yuan1, YANG Tao1, MA Zhuang-qiong2, ZHANG Hao1,ZHU Wan-long1, WANG Zheng-kun1

(1. Key Laboratory of Ecological Adaptive Evolution and Conservation on Animals-plants in Southwest Mountain Ecosystem of Yunnan Province Higher Institutes College, School of Life Sciences, Yunnan Normal University,Kunming 650500； 2. Weishan No.2 High School, Weishan, Dali 672401, China)

To investigate the genetic diversity of Orient voles (Eothenomysmiletus), DNA sequence variations in the mitochondrial cytochromebgene and control region of the 30 individuals from Jianchuan, Yunnan Province were measured. For cytochromebgene (Cytb), 16 nucleotide sites were variable (1.40% in the full sequences), including 3 transitions and 0 transversions among 1140 base pairs (bp), the nucleotide diversity (Pi) was 0.0296, the haplotypes diversity (Hd) was 0.876±0.041, and 12 haplotypes were identified in the 30 samples. For control region (D-loop), 987 base pairs were examined, 28 nucleotide sites were variable (2.84% in the full sequences), including 5 transitions and 1 transversions, the nucleotide diversity was 0.0055, the haplotypes diversity was 0.924±0.029, 16 haplotypes were identified in the 30 samples. Based on control region, the genetic diversity ofEothenomyswas less thanClethrionomys, so theEothenomyscould be younger thanClethrionomys, and the genetic diversity may be related with the distribution ranges and ecological factors.

ecology;Eothenomysmiletus; genetic diversity

2014-12-09；

2015-01-29

國家自然科學基金資助項目(No.31260097)；云南省應用基礎研究項目(No.2013FA014)

沐 遠，碩士在讀，研究方向：動物生理生態(tài)，E-mail: islam19891001@163.com；

朱萬龍，副教授，研究方向為動物生理生態(tài)，E-mail: zwl_8307@163.com；王政昆，教授，研究方向為動物生理生態(tài)，E-mail: wzk_930@126.com。

Q953

A

2095-1736(2015)05-0030-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.030