吳金連， 薛 勇， 黎海龍， 劉 健， 甘禮惠， 龍敏南

(廈門(mén)大學(xué) 能源學(xué)院， 廈門(mén) 361102)

東方肉座菌GH10家族木聚糖酶基因的克隆及異源表達(dá)

吳金連， 薛 勇， 黎海龍， 劉 健， 甘禮惠， 龍敏南

(廈門(mén)大學(xué) 能源學(xué)院， 廈門(mén) 361102)

木聚糖酶是降解半纖維素最主要的酶，對(duì)于開(kāi)發(fā)可再生生物能源具有重要的應(yīng)用價(jià)值。分別以東方肉座菌(Hypocreaorientalis)EU7-22的基因組DNA和cDNA為模板，利用染色體步移和PCR技術(shù)首次克隆獲得該菌GH10家族木聚糖酶Ⅲ的基因(xynⅢ)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：該基因全長(zhǎng)1283 bp(gxynⅢ)，含有3個(gè)內(nèi)含子；CDS序列為 1044 bp(cxynⅢ)，編碼347個(gè)氨基酸，N端含有一個(gè)16 aa的信號(hào)肽序列； XYNⅢ氨基酸序列與Trichodermapseudokoningii的endoxylanase具有較高的同源性。經(jīng)生物信息學(xué)分析，XYNⅢ成熟蛋白可能含有18個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其理論等電點(diǎn)(pI)為6.14，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為 36.55 ku，屬于親水性蛋白；SWISS-Model 建模預(yù)測(cè)，XYNⅢ成熟蛋白中含有11個(gè)α螺旋，其核心結(jié)構(gòu)為8個(gè)β折疊片圍成一個(gè)柱狀結(jié)構(gòu)。 同時(shí)將編碼成熟蛋白的基因片段mxynⅢ與pPIC9K質(zhì)粒連接構(gòu)建表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化畢赤酵母，對(duì)重組子表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶活檢測(cè)顯示該基因能在畢赤酵母中表達(dá)有生物活性的XYNⅢ并分泌到胞外，發(fā)酵液中的木聚糖酶活在誘導(dǎo)培養(yǎng)168 h后可達(dá)到 127.5 IU/mL。

東方肉座菌；木聚糖酶Ⅲ；基因克隆；生物信息學(xué)分析;異源表達(dá)

半纖維素的結(jié)構(gòu)主要由 β-D-吡喃木糖殘基經(jīng) β-1,4-糖苷鍵連接而成的主鏈以及各種側(cè)鏈(如葡萄糖醛酸側(cè)鏈、阿拉伯糖側(cè)鏈等)組成，因此半纖維素的徹底降解需要木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、葡萄糖醛酸酶等的協(xié)同作用[1]，其中木聚糖酶是降解半纖維素過(guò)程中最重要的水解酶。木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一類(lèi)能夠作用于木聚糖主鏈的糖苷鍵并生成木糖或低聚木糖的水解酶，在食品、造紙、紡織、醫(yī)藥及能源等領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[2]。木聚糖酶屬于糖苷水解酶(Glycosyl Hydrolases, GH)，在GH5、7、8、10、11、26和43家族中均存在[3]。其中GH10和GH11家族是木聚糖酶中被研究得最多的兩個(gè)家族，目前已從Malbrancheapulchella、ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumNTOU1、MyceliophthoraThermophila、Thermoascusaurantiacus等微生物中克隆得到了GH10木聚糖酶[4-7]。但是到目前為止，在木霉屬中僅有2個(gè)GH10木聚糖酶基因(Acession：EU360940.1和AB036796.1)被克隆。

木聚糖酶在自然界中分布廣泛，可從動(dòng)物、植物和微生物中直接分離純化或者定向誘導(dǎo)表達(dá)獲得，目前木聚糖酶的生產(chǎn)多數(shù)依靠真菌、細(xì)菌等微生物的發(fā)酵[8]。但是木聚糖酶在天然生物中表達(dá)水平低，且酶系組分復(fù)雜，分離純化過(guò)程較為復(fù)雜且成本高限制了其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)從天然菌株中克隆木聚糖酶基因并實(shí)現(xiàn)其在合適的宿主中高效表達(dá)，可以克服以上缺點(diǎn)，同時(shí)還能獲得特異性的木聚糖酶。而畢赤酵母就是一種較為理想的真核蛋白表達(dá)宿主。

東方肉座菌(Hypocreaorientalis)EU7-22是本課題組通過(guò)篩選、誘變獲得的一株木霉屬(Trichoderma)真菌。已有研究表明，該菌株不僅具有較高的濾紙酶、β-葡萄糖苷酶等纖維素酶活性[9]，而且具有較高的GH10和GH11家族木聚糖酶活力。通過(guò)對(duì)該菌株粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE及LC-MS/MS分析，推測(cè)GH10木聚糖酶是該菌株表達(dá)的主要木聚糖酶[10]。目前，本課題組已經(jīng)成功地從該菌株中克隆了外切葡聚糖酶基因、內(nèi)切葡聚糖酶基因及β-葡萄糖苷酶基因等纖維素酶基因，并實(shí)現(xiàn)了葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)[9-10]。同樣地，東方肉座菌EU7-22中的兩個(gè)GH11木聚糖酶基因也被成功克隆并在畢赤酵母中重組表達(dá)[12-13]，但GH10木聚糖酶的基因重組表達(dá)仍屬空白。因此，有必要從東方肉座菌EU7-22中克隆GH10木聚糖酶的xynⅢ序列(gxynⅢ)和CDS序列(cxynⅢ)，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用真核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建xynⅢ的畢赤酵母重組表達(dá)菌株，以實(shí)現(xiàn)其胞外分泌高效表達(dá)，從而為進(jìn)一步研究XYNⅢ的酶學(xué)性質(zhì)以及蛋白工程研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑

TaKaRa Ex Taq，genome walking kit，DNA Marker 和pMD19-T 載體均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基

菌株：東方肉座菌(HypocreaOrientalis)EU7-22，大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH值7.2；固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂粉。

NN培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO415 g/L，MgSO40.6 g/L，CaCl20.6 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·H2O 0.0016 g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014 g/L，CoCl20.002 g/L，121℃高壓滅菌。

誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米芯粉20 g/L，麩皮10 g/L，蛋白胨5 g/L，CaCl25 g/L，MgSO45 g/L，KH2PO42.5 g/L，Tween-80 4 mL/L，調(diào)pH值至5.5，121℃高壓滅菌。

YPD、MD、MM、BMMY培養(yǎng)基見(jiàn)Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA提取

將東方肉座菌EU7-22在NN培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，過(guò)濾收集菌體，按CTAB法提取東方肉座菌EU7-22總DNA[14-15]。

1.2.2 總RNA提取

將東方肉座菌EU7-22固體NN平板活化后，轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，離心收集菌體；菌體用液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL無(wú)菌離心管中，加入1 mL TRIzol裂解液，混勻至無(wú)沉淀后，室溫靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，靜置5 min后，12 000 g 4℃離心15 min，收集上清棄沉淀。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10 min，離心后棄上清液， 沉淀用75%乙醇洗滌后，用DEPC水溶解，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3xynⅢ部分片段的克隆

根據(jù)GenBank中里氏木霉(accession number: AB036796.1)和康寧木霉(accession number: EU360940.1)的GH10木聚糖酶基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物Pxyn3-F和Pxyn3-R(表1)，以東方肉座菌基因組DNA為模板克隆xynⅢ的部分序列(PxynⅢ)。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收后連接到pMD19-T載體上，然后轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)，先通過(guò)氨芐青霉素LB抗性平板篩選，再以M13通用引物對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行篩選和測(cè)序(上海生工)，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4PxynⅢ上游和下游片段克隆

根據(jù)TaKaRa的染色體步移試劑盒說(shuō)明書(shū)，結(jié)合文獻(xiàn)[6]，設(shè)計(jì)擴(kuò)增PxynⅢ片段上下游序列的巢氏引物，如表1所示：Pxyn3-U1，Pxyn3-U2，Pxyn3-U3為克隆PxynⅢ上游序列的巢氏引物；Pxyn3-D1，Pxyn3-D2，Pxyn3-D3為克隆PxynⅢ下游序列的巢氏引物。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序都根據(jù)染色體步移試劑盒的說(shuō)明書(shū)來(lái)設(shè)計(jì)。通過(guò)3次巢氏PCR得到的PxynⅢ上下游片段分別經(jīng)過(guò)膠回收后連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，然后通過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選，再以M13通用引物對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行篩選和測(cè)序(上海生工)。

1.2.5cxynⅢ的克隆

通過(guò)DNAMAN軟件分析PxynⅢ及其上下游片段的序列并對(duì)其進(jìn)行拼接，得到包括xynⅢ和其上下游片段的序列，將此序列通過(guò)NCBI比對(duì)確定gxynⅢ序列。根據(jù)gxynⅢ序列設(shè)計(jì)引物xyn3-F和xyn3-R擴(kuò)增xynⅢ的CDS序列。PCR的模板是通過(guò)PrimeScriptTMII Reverse Transcriptase試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到的單鏈cDNA。PCR程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸80 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收后連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，先通過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選，再以M13通用引物對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行篩選和測(cè)序(上海生工)，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)。

表1 東方肉座菌木聚糖酶Ⅲ基因克隆引物

注：下劃線(xiàn)分別為EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)序列。

1.2.6xynⅢ序列的生物信息學(xué)分析

將克隆獲得的gxynⅢ序列與cxynⅢ序列用DNAMAN軟件分析基因內(nèi)含子；將gxynⅢ序列與cxynⅢ在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；利用SignalP 4.1軟件分析N-末端信號(hào)肽序列(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建使用軟件MEGA6.06軟件中的Neighbor-Joining法完成；用ProtParam工具分析cxynⅢ編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)(http://web.expasy.org/protparam)；利用NetNGlyc軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)；利用Prosite motif search對(duì)蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn)進(jìn)行搜索(http://prosite.expasy.org/)；利用SWISS-Model在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)和模擬蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(http://swiss-model.expasy.org/workspace/index.php?)[11, 15]。

1.2.7xynⅢ在畢赤酵母中的表達(dá)

根據(jù)cxynⅢ(去掉信號(hào)肽)的基因序列設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)的引物cxyn3-F/R，利用該引物克隆xynⅢ并構(gòu)建含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)的T載體pMD19-T-xynⅢ，具體方法步驟參照1.2.5。將pMD19-T-xynⅢ接種于LA液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，大量提取pMD19-T-xynⅢ質(zhì)粒，用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收目的片段，定向插入到帶有高效甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子AOX的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上的EcoRⅠ和NotⅠ位點(diǎn)之間，形成重組質(zhì)粒pPIC9K-xynⅢ。重組質(zhì)粒均經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。

將重組質(zhì)粒pPIC9K-xynⅢ用SalⅠ線(xiàn)性化后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母PichiapastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于缺少組氨酸的MD平板，28℃條件下培養(yǎng)2～3 d至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。MD平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子用pPIC9K AOX通用引物和cxyn3-F/R引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。根據(jù)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物片段的大小就可判斷目的基因的插入是否存在。

將PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用1%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h取樣并測(cè)定粗酶液的木聚糖酶活力。

1.2.8 木聚糖酶活性測(cè)定

采用改進(jìn)的DNS法測(cè)定[17]木聚糖酶活。取0.2 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液于具塞試管中，加入1.8 mL 1%山毛櫸木聚糖底物，于50℃下溫育10 min后加入3 mL DNS試劑終止反應(yīng)。沸水浴5 min顯色后，冷卻至室溫，定容，測(cè)D540 nm吸光值。同時(shí)，以加入0.2 mL離子水代替粗酶液為空白對(duì)照。

木聚糖酶活力的定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘水解1%木聚糖底物釋放1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(IU)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶Ⅲ基因部分片段的克隆

以東方肉座菌EU7-22 DNA為模板，利用Pxyn3-F和Pxyn3-R以引物獲得的東方肉座菌木聚糖酶Ⅲ基因的部分片段大小約1.2 kb(圖1A)，測(cè)序后得到的PxynⅢ大小為1216 bp，通過(guò)NCBI比對(duì)結(jié)果分析得到這個(gè)基因片段是屬于木聚糖酶Ⅲ基因的部分片段。

2.2PxynⅢ上游和下游片段克隆

以引物Pxyn3-U1和genome-walking試劑盒提供的簡(jiǎn)并引物AP1、AP2、AP3、AP4進(jìn)行第1次巢氏PCR，然后將產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)稀釋后為模板，利用Pxyn3-U2和簡(jiǎn)并引物AP1、AP2、AP3、AP4進(jìn)行第2次巢氏PCR，最后以第2次巢氏PCR的產(chǎn)物為模板，利用Pxyn3-U3和簡(jiǎn)并引物AP1、AP2、AP3、AP4進(jìn)行第3次巢氏PCR。對(duì)3次PCR結(jié)果進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)選擇AP2簡(jiǎn)并引物時(shí)能得到PxynⅢ的上游片段，AP2引物和Pxyn3-U1、Pxyn3-U2、Pxyn3-U3 3次巢氏PCR的結(jié)果見(jiàn)圖1B。從圖中可知第3次巢氏PCR得到了相應(yīng)的條帶，膠回收第二泳道的1.2 kb左右的條帶，通過(guò)測(cè)序該得到1203 bp的片段。以引物Pxyn3-D1、Pxyn3-D2、Pxyn3-D3和簡(jiǎn)并引物AP1、AP2、AP3、AP4克隆PxynⅢ下游序列，實(shí)驗(yàn)過(guò)程同上游序列的克隆過(guò)程。經(jīng)過(guò)3次巢氏PCR后發(fā)現(xiàn)下游克隆最適合的簡(jiǎn)并引物也為AP2，3次巢氏PCR的結(jié)果見(jiàn)圖1C，從圖中可以看出第3次巢氏PCR的產(chǎn)物濃度也很低，膠回收第二泳道的PCR產(chǎn)物(約1.6 kb)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)序得到1654 bp的基因片段。

2.3cxynⅢ的克隆

將PxynⅢ(1216 bp)和染色體步移法得到的PxynⅢ上游序列(1203 bp)和下游序列(1654 bp)通過(guò)DNAMAN比對(duì)和拼接后得到3923 bp，將此序列通過(guò)NCBI比對(duì)和DNAMAN等軟件分析得到東方肉座菌木聚糖酶Ⅲ在基因組上的長(zhǎng)度為1283 bp，其上游序列為1164 bp，下游序列為1476 bp。以引物xyn3-F和xyn3-R從東方肉座菌基因組DNA克隆gxynⅢ序列(圖1 D)并從cDNA克隆cxynⅢ序列(圖1 E)，其大小分別約為1.2 kb和1.0 kb，測(cè)序得到大小分別為1283 bp和1044 bp。之后將cxynⅢ序列信息成功提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為: KP641167。

2.4 木聚糖酶基因序列的生物信息學(xué)分析

2.4.1 木聚糖酶基因序列內(nèi)含子及同源性分析

圖1 xynⅢ片段的瓊脂糖凝膠電泳

M—DNA Marker； 1—PxynⅢ； 2-4—PxynⅢ上游第1, 2, 3次 PCR； 5-7—PxynⅢ下游第1, 2, 3次PCR; 8—gxynⅢ; 9—cxynⅢ。

總DNA克隆得到的木聚糖酶Ⅲ基因gxynⅢ全長(zhǎng)1283 bp，總RNA克隆得到的木聚糖酶Ⅲ基因cxynⅢ全長(zhǎng)1044 bp，DNAMAN軟件分析得知gxynⅢ基因含有3個(gè)內(nèi)含子，位于515～600 bp、837～926 bp和1129～1191 bp處，3個(gè)內(nèi)含子都符合GT-AG規(guī)則。利用Primer Premier 5.0將cxynⅢ翻譯成相應(yīng)氨基酸序列(命名為XYNⅢ)并利用NCBI中的Protein blast分析，結(jié)果顯示：cxynⅢ編碼的蛋白質(zhì)屬于糖苷水解酶(GH) 10家族，與擬康氏木霉Trichodermapseudokoningii內(nèi)切木聚糖酶(Accession：ABY71931.1)氨基酸序列同源性最高，達(dá)到98%。選擇與XYNⅢ同源性大于60%以上的21個(gè)木聚糖酶和3個(gè)糖苷水解酶11家族的木聚糖酶，使用MEGA6.06軟件的NJ法構(gòu)建包括XYNⅢ在內(nèi)的25個(gè)酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。從圖2中可以看出，XYNⅢ與擬康氏木霉Trichodermapseudokoningii內(nèi)切木聚糖酶進(jìn)化上最接近，其次是里氏木霉的木聚糖酶(Accession: XP 006962419.1)，與其他木霉的GH10家族的木聚糖酶都在同一個(gè)分支，說(shuō)明XYNⅢ是木霉屬的GH10家族木聚糖酶。

2.4.2 信號(hào)肽分析

用SignalP 4.1軟件分析cxynⅢ編碼的氨基酸序列XYNⅢ，結(jié)果顯示：該酶蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽，由N-末端的前1～16個(gè)氨基酸(MKANAILCLLAPLIAA)組成。由此推測(cè)，東方肉座菌EU7-22 XYNⅢ的成熟蛋白有331個(gè)氨基酸。

圖2 木聚糖酶Ⅲ基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

注：使用MEG6.06軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建25個(gè)木聚糖酶氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，節(jié)點(diǎn)的數(shù)值代表步長(zhǎng)值。

2.4.3 基本理化性質(zhì)分析

ProtParam分析表明，東方肉座菌EU7-22 XYNⅢ (去掉信號(hào)肽) 有331個(gè)氨基酸，該蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量為 36.55 ku，等電點(diǎn)pI為6.14。負(fù)荷殘基總數(shù)(Asp+Glu) 為33，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為31，分子式為C1624H2551N459O497S3，原子總數(shù)為5134；脂肪系數(shù)為92.24，Grand average of hydropathicity (GRAVY)親水性評(píng)估為-0.320，為親水性蛋白。

2.4.4 糖基化分析

NetNGly分析顯示，東方肉座菌EU7-22 XYNⅢ酶蛋白可能含有18個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N4VIL、N34LTE、N77AAI、N92SMK、N101NQG、N102QGQ 、N107WGD、N116FAQ、N121GKL、N141NIN、N142INN、N144NAD、N145ADT、N175EIF、N179EDG、N217DYN、N220LDS、N230GLK、N291DYT、N302VSK、N325PLL、N332FNP、N334PKP和N340SIV)，見(jiàn)圖3。

圖3 XYNⅢ酶蛋白N-糖基化位點(diǎn)分析

注：Threshold=0.5，為N糖基化位點(diǎn)的臨界值，數(shù)值超過(guò)0.5可能為糖基化位點(diǎn)，數(shù)值越高，引起N糖基化的可能性越大。

2.4.5 蛋白Prosite motif search分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用Prosite motif search對(duì)蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn)進(jìn)行分析，分析發(fā)現(xiàn)：該XYNⅢ蛋白可能含有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N18LTE和N286VSK)，8個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，5個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)。

利用SWISS-Model對(duì)XYNⅢ蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模。通過(guò)SWISS-Model在線(xiàn)預(yù)測(cè)，XYNⅢ與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)編號(hào)為1K6A(來(lái)自Thermoascusaurantiacusxylanase I[18])的相似度為65.89%。以PDB：1K6A為模板序列，預(yù)測(cè)XYNⅢ第30～331位氨基酸殘基的三級(jí)結(jié)構(gòu)，α螺旋和β折疊分別標(biāo)記為紅色和黃色，無(wú)規(guī)則卷曲為白色，得到東方肉座菌EU7-22 XYNⅢ蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型(見(jiàn)圖4)。該模型含有11個(gè)α螺旋，其核心結(jié)構(gòu)為8個(gè)β折疊片圍成一個(gè)柱狀結(jié)構(gòu)。

圖4 XYNⅢ蛋白的三維結(jié)構(gòu)模擬圖

圖5 菌落PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

M—Protein marker； 1-7—The transformants； 注：1 500左右的條帶為與目的基因相關(guān)的片段，2 200左右的條帶為AOX1基因片段。

2.5xynⅢ在畢赤酵母中的表達(dá)

成功構(gòu)建了pPIC9K-mxynⅢ重組表達(dá)質(zhì)粒，成功地轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母中，經(jīng)過(guò)MD平板篩選后的轉(zhuǎn)化子利用菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖5。由圖5可知，獲得了若干株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將這些陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子用G418抗性篩選出高拷貝轉(zhuǎn)化子，高拷貝的轉(zhuǎn)化子再點(diǎn)接于MM平板上進(jìn)行甲醇利用表型的鑒定。篩選的高拷貝轉(zhuǎn)化子用YPD培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，用1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，在上清液均檢測(cè)到木聚糖酶活力。篩選出產(chǎn)木聚糖酶活較高的菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h取樣收集到的上清液按照1.2.8所述的方法測(cè)定木聚糖酶活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)表明：xynⅢ在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了異源高效表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，發(fā)酵液中的木聚糖酶活也不斷增加，在誘導(dǎo)培養(yǎng)168 h后達(dá)到了 127.5 IU/mL。

圖 6 重組轉(zhuǎn)化子GS115(pPIC9K- mxynⅢ)的誘導(dǎo)產(chǎn)酶曲線(xiàn)

3 討論

本研究使用染色體步移等基因克隆技術(shù)，首次從東方肉座菌EU7-22基因組中克隆得到了GH10家族木聚糖酶的cDNA序列，該序列編碼一個(gè)由331個(gè)氨基酸組成的蛋白，N端包括一個(gè)由16個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽(見(jiàn)圖7)。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，該基因編碼的蛋白酶屬于GH10家族木聚糖酶，且與擬康氏木霉內(nèi)切木聚糖酶有最高的同源性。

在真核微生物中所產(chǎn)的木聚糖酶被糖基化是比較普遍的，通常認(rèn)為糖基化不僅利于酶抵御極端環(huán)境，而且也是木聚糖酶多樣性的重要原因之一[2]。預(yù)測(cè)蛋白的N糖基化和理化性質(zhì)，對(duì)于蛋白的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定具有重要的指導(dǎo)作用。如表達(dá)的酶蛋白實(shí)際分子量大小以及出現(xiàn)多個(gè)蛋白條帶的原因、酶活性的高低、不同pH值下酶活高低等，可能與酶蛋白的糖基化或理化性質(zhì)有關(guān)。因此，對(duì)XYNⅢ進(jìn)行了N糖基化預(yù)測(cè)分析和理化性質(zhì)分析。此外，通過(guò)對(duì)東方肉座菌XYNⅢ蛋白功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)以及蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬，不僅有利于對(duì)xynⅢ和XYNⅢ的進(jìn)一步了解，而且為今后構(gòu)建具有高催化活性的酶蛋白突變體提供依據(jù)[19]。在此基礎(chǔ)上，本研究首次成功地對(duì)東方肉座菌GH10家族木聚糖酶基因xynⅢ進(jìn)行了克隆以及實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母中的高效表達(dá)，為XYNⅢ的蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。獲得該酶的酶學(xué)性質(zhì)是該酶大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用的前提，因此，該酶的酶學(xué)性質(zhì)以及一些潛在的特性有待進(jìn)一步研究。

圖7 xynⅢ cDNA序列和氨基酸序列

注：帶有下劃線(xiàn)的表示起始密碼子和終止密碼子；帶有方框的表示信號(hào)肽序列。

[1]吳金連, 薛 勇, 黎海龍, 等. 半纖維素側(cè)鏈降解酶——α-葡萄糖醛酸酶的研究進(jìn)展[J]. 新能源進(jìn)展, 2014, 2(5):327-333.

[2]Kulkarni N, shendye A, Mala R. Molecular and biotechnological aspects of xylanases[J]. FEMS Microbiology Reviews, 1999, 23: 411-456.

[3]Juturu V, Wu J C. Microbial xylanases: engineering, production and industrial applications[J]. Biotechnol Adv, 2012, 30(6): 1219-1227.

[4]Kolenova K, Vrsanska M, Biely P. Mode of action of endo-beta-1,4-xylanases of families 10 and 11 on acidic xylooligosaccharides[J]. J Biotechnol, 2006, 121(3): 338-345.

[5]Ribeiro L F C, De Lucas R C, Vitcosque G L, et al. A novel thermostable xylanase GH10 from Malbranchea pulchella expressed inAspergillusnidulanswith potential applications in biotechnology[J]. Biotechnology for Biofuels, 2014, 7(1): 115.

[6]Hung K S, Liu S M, Tzou W S, et al. Characterization of a novel GH10 thermostable, halophilic xylanase from the marine bacteriumThermoanaerobacteriumsaccharolyticumNTOU1[J]. Process Biochemistry, 2011, 46(6): 1257-1263.

[7]van Gool M P, van Muiswinkel G C, Hinz S W, et al. Two GH10 endo-xylanases fromMyceliophthorathermophilaC1 with and without cellulose binding module act differently towards soluble and insoluble xylans[J]. Bioresour Technol, 2012, 119:123-132.

[8]Subramaniyan S, Prema P. Biotechnology of microbial xylanases: enzymology, molecular biology, and application[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2002, 22 (1):33-64.

[9]成奕瑾, 張 婷, 黎海龍, 等. β-葡萄糖苷酶的異源表達(dá)及與纖維素酶協(xié)同酶解竹纖維[J]. 新能源進(jìn)展, 2013, 3(1): 230-235.

[10]Li H, Liu J, Wu J, et al. Comparative analysis of enzymatic hydrolysis ofMiscanthusxylan usingAspergillusniger,Hypocreaorientalis[J]. BioResources, 2014, 9(2): 2191-2202.

[11]龍傳南, 成奕瑾, 鄔小兵, 等. 東方肉座菌EU7-22纖維素酶基因的克隆及序列分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2012(11): 110-117.

[12]龍傳南, 蔣鳳姣, 鄔小兵, 等. 東方肉座菌EU7-22木聚糖酶和木糖苷酶基因克隆及生物信息學(xué)研究[J]. 生物信息學(xué), 2013, 11(1): 58-64.

[13]Li H, Wu J, Jiang F, et al. Functional expression and synergistic cooperation of xylan-degrading enzymes fromHypocreaorientaliandAspergillusniger[J]. J Chem Technol Biotechnol, 2014, DOI: 10. 1002/jctb. 4521.

[14]黃 恒, 王曉麗. 采用CTAB與SDS法提取白術(shù)DNA的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(7): 2860-2861.

[15]Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research, 1980, 8(19): 4321-4325.

[16]梁成真, 張 銳, 郭三堆. 染色體步移技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2009(10):75-87.

[17]Cai H, Shi P, Bai Y, et al. A novel thermoacidophilic family 10 xylanase fromPenicilliumpinophilumC1[J]. Process Biochemistry, 2011, 46 (12): 2341-2346.

[18]Teixeira S, Lo L, Pickersgill R, et al. Anisotropic refinement of the structure ofThermoascusaurantiacusxylanase I[J]. Acta Crystallogr D·Biol crystallogr, 2001, 57(3): 385-392.

[19]Paes G, Berrin J G, Beaugrand J. GH11 xylanases: Structure/function/properties relationships and applications[J]. Biotechnol Adv, 2012, 30(3): 564-592.

Cloning and heterologous expression of a novel GH10 xylanase gene fromHypocreaorientalisEU7-22

WU Jin-lian， XUE Yong， LI Hai-long， LIU Jian， GAN Li-hui， LONG Min-nan

(College of Energy, Xiamen University, Xiamen 361102, China)

Endo-1,4-xylanase (E.C.3.2.1.8) is the major enzyme to the conversion of hemicelluloses into xylo-oligosaccharide. In this research, a novel GH10 xylanaseⅢ (xynⅢ) gene was cloned fromHypocreaorientalisEU7-22 by chromosome walking and PCR. The results showed that the DNA fragment (1283 bp) encodingxynⅢ (gxynⅢ) contained three introns. The CDS ofxynⅢ (cxynⅢ) encoded 331 amino acids of putative mature protein and a 16 aa signal in N terminator. The amino acid sequence ofxynⅢ is highly homologous with the endoxylanase ofTrichodermapseudokoningii. The bioinformatics analysis showed that the theoretical isoelectric point and the molecular weight of putative mature protein of XYNⅢ were 6.14 and 36.55 ku, respectively. It is a soluble hydrophilic protein containing 18 N-glycosylation sites. The 3D structure predicted with SWISS-Model showed that XYNⅢ protein contained 11 alpha helices and 8 extended strands. A recombinant plasmid pPIC9K-xynⅢ was constructed and then transformed intoPichiapastoris. The transformant identified by PCR was induced to produce XYNⅢ enzyme with 1% methanol. And after 168 hours induced expression, the produced crude enzyme was detected to reach a high enzymatic activity of 127.5 IU/mL.

Hypocreaorientalis; xylanase Ⅲ; gene clone; bioinformatics analysis; heterologous expression

2015-02-05；

2015-02-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(21303142，31170067)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(閩海洋高新[2014] 25號(hào))；廈門(mén)市海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(14GZP59HJ29)

吳金連，碩士，研究方向?yàn)樯锬茉矗珽-mail：jinlwu@foxmail.com；薛 勇，博士，研究方向?yàn)樯锬茉矗珽-mail：lxylinyu@163.com；吳金連和薛勇為共同第一作者；

龍敏南，博士，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)資源利用，E-mail: longmn@xmu.edu.cn。

Q786

A

2095-1736(2015)05-0001-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.001