安冬琴, 王曉麗

(貴陽醫(yī)學(xué)院 藥用植物與生藥學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004)

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響應(yīng)面法優(yōu)化黔產(chǎn)金櫻子總黃酮超聲提取工藝*

安冬琴, 王曉麗**

(貴陽醫(yī)學(xué)院 藥用植物與生藥學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004)

目的： 優(yōu)選黔產(chǎn)金櫻子中總黃酮的提取工藝。方法： 選取液料比、乙醇濃度和提取時間為自變量，黔產(chǎn)金櫻子中總黃酮的提取率為因變量，對自變量各水平進行多元線性回歸和二項式擬合，采用響應(yīng)面法選擇最佳工藝條件，并進行預(yù)測分析。結(jié)果： 確定最優(yōu)提取工藝是料液比為1∶30，乙醇濃度為65%，提取時間為90 min。結(jié)論： 響應(yīng)面法優(yōu)化的金櫻子中總黃酮的超聲提取工藝簡便可靠。

金櫻子; 黃酮; 超聲處理; 響應(yīng)面法

金櫻子是薔薇科植物金櫻子(RosalaevigataMichx.)的干燥成熟果實，又名蜂糖罐,糖罐子、刺榆子、金壺瓶等，臨床用于遺精滑精，遺尿尿頻，崩漏帶下，久瀉久痢的治療，在我國西南、華南、華中、華東均有分布，尤其以貴州省分布廣，產(chǎn)量高[1-2]。《中國藥典》規(guī)定金櫻子的質(zhì)量控制指標(biāo)為多糖，所以對其多糖研究甚多[3-5]。在金櫻子中黃酮也是含量較高的化合物，對其提取工藝的研究很少。星點設(shè)計是在二水平析因設(shè)計的基礎(chǔ)上增加了中心點和極值點，具有試驗次數(shù)低、精密度高等優(yōu)勢[6]。本試驗采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選金櫻子的超聲提取工藝，為黔產(chǎn)金櫻子的資源開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(貴州省食品藥品檢驗所，批號100080-200707)，金櫻子：采于黔東南曬干產(chǎn)品，經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院王曉麗教授鑒定，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等所以試劑均為分析純。電子天平HZT-A500(福州華志科學(xué)儀器有限公司)、植物粉碎機(河北黃驊縣齊家務(wù)科學(xué)儀器廠)、標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩(浙江上虞市道墟張興紗篩廠)、KDM型調(diào)溫電熱套(武漢精華科教儀器有限公司)、98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)、UV-2401紫外分光光度計(日本島津)、HH-2數(shù)恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司)、101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海路達實驗儀器有限公司)、臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械有限公司分術(shù)器械廠)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻[7-8]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取蘆丁0.012 5 g于25 mL容量瓶中，加適量60%乙醇水浴加熱使其完全溶解，在加60%乙醇定容，得到終濃度為0.5 g/L的對照品溶液。精密量取0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL的0.5 g/L 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于15 mL容量瓶中，再依次加5%亞硝酸鈉0.3 mL搖勻靜止6 min,加10%硝酸鋁0.3 mL搖勻靜止6 min,加1mol/L氫氧化鈉4 mL再加60%乙醇定容至刻度，搖勻靜止15 min，在最大吸收波長處檢測其吸光度值；再以吸光度值為縱坐標(biāo)y,蘆丁濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：A=4.154 4C+0.051 6 (R2=0.999 4),濃度在0.033 3 g/L～0.266 7 g/L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。

1.3 金櫻子樣品溶液的制備

稱取金櫻子粉末2 g，置于100 mL三角燒瓶中，加入60%乙醇40 mL，超聲回流提取2次，每次40 min，抽濾，用60%乙醇少量多次洗滌，合并兩次濾液，濃縮為10 mL，60%乙醇定容至100 mL，即得樣品溶液。

1.4 星點設(shè)計試驗

參照文獻[9-11]進行星點設(shè)計實驗。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，考慮因素為液料比、乙醇濃度和提取時間。通過Design-Expert7.0.0軟件，根據(jù)星點設(shè)計原理，每因素5水平，用代碼值-α,-1,0,1,α表示三因素[12]，α=(23)1/4，以液料比、乙醇濃度和提取時間為自變量，金櫻子總黃酮提取率為因變量進行優(yōu)化，設(shè)計因素水平表見表1，星點試驗設(shè)計見表2。用軟件Design-Expert7.0.0軟件包對各因素進行多元回歸與方差分析，回歸分析結(jié)果見表3。優(yōu)化后的二次多項式方程:黃酮提取率=+7.73+0.39 ×A-0.16 ×B+0.79 ×C-0.18 × A ×B-0.029 ×A ×C-0.11 × B × C+0.12×A2-0.30 ×B2-0.35 ×C2 (r=0.972 4),表明有97.24% 總黃酮提取率的變差歸因于3個因素的變化。用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值的關(guān)系時，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著(r=0.972 4)，見表3。

表1 響應(yīng)曲面因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface method

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案與結(jié)果Tab.2 Experiment design and result of response surface method

表3 回歸分析結(jié)果Tab.3 Regression analysis results

1.5 響應(yīng)曲面圖繪制及工藝條件優(yōu)化

根據(jù)擬合的二次多項式方程，繪制總黃酮含量隨因素變化的響應(yīng)面圖，見圖1～3。每個響應(yīng)面都具有較優(yōu)區(qū)域，將各較優(yōu)區(qū)域重疊，可以進一步縮小較佳條件范圍[13]。 Design ExperI軟件為效應(yīng)面分析提供了最佳條件化優(yōu)化模塊，在進行數(shù)字化優(yōu)化時，根據(jù)各因素水平設(shè)定各因素自變量區(qū)間，效應(yīng)值選擇極大值，得到黔產(chǎn)金櫻子的最佳工藝條件為料液比1∶30，乙醇濃度62.58%，提取時間90 min。

圖1 液料比和乙醇濃度影響總黃酮提取率的3D響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 3D response surface and contour plot of the effect of liquid ratio and ethanol concentration on flavonoid extraction yield

圖2 液料比和提取時間影響總黃酮提取率的3D響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 3D response surface and contour plot of the effect of liquid ratio and extracting time on flavonoid extraction yield

圖3 提取時間和乙醇濃度影響總黃酮提取率的3D響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 3D response surface and contour plot of the effect of extracting time and ethanol concentration on flavonoid extraction yield

1.6 驗證實驗

精密稱取黔產(chǎn)金櫻子6份，驗證其試驗的的適用性。為了實際操作將Design ExperI軟件為效應(yīng)面分析提供的最佳條件設(shè)為料液比1∶30、乙醇濃度65%和提取時間為90 min，實際測得總黃酮提取率為8.09%、8.57%、8.36%、7.92%、7.68%、8.18%，平均提取率為8.13%，與預(yù)期值8.83%相差0.7%。說明所建立的模型預(yù)測性較好，可用于金櫻子中總黃酮提取工藝的優(yōu)選。

2 討論

本試驗采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在496 nm處測定吸光度值，該方法簡單、易操作。

星點設(shè)計-響應(yīng)面法采用非線性模型擬合，中心點試驗的重復(fù)次數(shù)越多，精確度越高，本文采用6次重復(fù)試驗，建立的方法簡便合理、穩(wěn)定，可預(yù)測性較優(yōu)[14]；在優(yōu)選的最佳工藝條件下，進行多次試驗取平均值，再與數(shù)學(xué)模型預(yù)測值進行比較，實驗值與預(yù)測值的偏差表示實驗值偏離預(yù)測值的程度，其絕對值越小，說明預(yù)測性越好[15-17]。所以星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選的最佳提取黔產(chǎn)金櫻子中總黃酮的提取工藝為料液比1∶30，乙醇濃度65%，提取時間90 min。

2010年版《中國藥典》中用金櫻子多糖的含量測定作為質(zhì)量的控制指標(biāo)，但市場上的金櫻子質(zhì)量參差不齊,還有一些摻假的現(xiàn)象,少數(shù)不法商販利用糖水浸泡金櫻子以增加含糖量,以次充好。所以只檢測多糖含量存在一定的缺陷。試驗增加金櫻子有效成分總黃酮的含量測定來補充其質(zhì)量指標(biāo)，并對其提取工藝進行優(yōu)化，為金櫻子的質(zhì)量研究提供實驗依據(jù)。

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(2015-03-06收稿，2015-04-24修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 趙 毅

Optimization of Extraction Parameters of Total Flavonoids fromRosalaevigataeMichx. from Guizhou Applying Response Surface Technique

AN Dongqin, WANG Xiaoli

(SchoolofPharmacy,GuiyangMedicalColege,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To optimize the extracting process of total flavonoids inRosalaevigataMichx. from Guizhou. Method: Selecting solid-liquid ratio, ethanol concentration and extraction time as independent variables, and yield of the total Flavonoids inRosaLaevigataeMichx. from Guizhou as dependent variables. Multiple linear regression and binomial fitting was adopted to handle each level of independent variables, and determine optimized extraction process by applying response surface technique, then predict analysis results．Result： The best extraction process was as following: ratio of solid to liquid 1∶30, ethanol concentration 65%，extraction time 90 min．Conclusions: This optimized extraction process is simple and reliable.

RosalaevigataeMichx.；total flavonoids；sonication；response surface method

貴州省科學(xué)技術(shù)廳基金項目(黔科合ZY字(2012)3004號)

時間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1253.018.html

R931.6

A

1000-2707(2015)05-0459-04

**通信作者 E-mail:346195348@qq.com