張文艷， 孫寶飛， 余資江**， 余 彥， 肖朝倫， 王玉林， 羅時(shí)鵬， 令狐艷

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院附院 呼吸內(nèi)科， 貴州 貴陽 550004)

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松樹皮原花青素對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

張文艷1，2， 孫寶飛1， 余資江1**， 余 彥1， 肖朝倫1， 王玉林1， 羅時(shí)鵬1， 令狐艷1

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004；2.貴陽醫(yī)學(xué)院附院 呼吸內(nèi)科， 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討松樹皮提取物原花青素對缺血再灌注小鼠腦損傷海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。方法： 120只雄性昆明小鼠隨機(jī)分成正常對照組、假手術(shù)組、14 d模型組、28 d模型組、14 d治療組、28 d治療組，采取小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎缺血15 min，再灌注15 min構(gòu)建腦缺血再灌注損傷模型，治療組給予松樹皮提取物原花青素灌胃治療， Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，造模后第14、28天處死小鼠，HE染色法觀察小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)改變，透射電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果： Morris水迷宮結(jié)果顯示模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，與模型組相比，治療組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有所提升；14 d模型組腦細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少，胞漿著色淺，胞核移位，治療組尼氏體排列欠規(guī)律，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿著色相對較淺，但比模型組好；電鏡下，小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元在14 d模型組損傷嚴(yán)重，神經(jīng)元胞體水腫、出現(xiàn)核固縮溶解現(xiàn)象，存在細(xì)胞器溶解后形成的空泡，線粒體嵴可見有斷裂，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體， 28 d模型組有所恢復(fù)，14 d和28 d治療組神經(jīng)元較同期模型組輕。結(jié)論： 松樹皮提取物原花青素對腦缺血再灌注損傷小鼠具有保護(hù)作用。

松樹皮提取物；原花青素；再灌注損傷；海馬；顯微鏡檢查，電子，掃描；細(xì)胞保護(hù)

腦缺血再灌注后引起的不可逆性的腦功能損害是臨床治療的難點(diǎn)。腦損傷后，神經(jīng)細(xì)胞的死亡可分為2種，一種是直接損傷引起的細(xì)胞死亡，第二種是繼發(fā)性損傷引起的遲發(fā)性細(xì)胞死亡，目前對直接損傷引起的細(xì)胞死亡還無法避免，而對繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用是當(dāng)今腦保護(hù)治療的關(guān)鍵[1]。松樹皮提取物中含有原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPCs)，具有極強(qiáng)的抗氧化活性，是一種很好的自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑[2-3]。本研究以腦缺血再灌注小鼠為研究對象，觀察松樹皮提取物OPCs對腦缺血再灌注損傷小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響，同時(shí)觀察小鼠海馬超微結(jié)構(gòu)變化情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年昆明種雄性小白鼠120只， 體重20～22 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號為SCXK[(黔)2002-0001]，按隨機(jī)分組原則，將120只小鼠分為正常對照組、假手術(shù)組、14 d模型組、28 d模型組、14 d治療組和28 d治療組，每組各20只。室溫為(20±2)℃，濕度48%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

松樹皮提取物(西安賽奧生物技術(shù)有限公司)，Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，透射電子顯微鏡(FEI公司TECNAI10)。

1.3 腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ徒?/p>

小鼠以3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒，自下頜骨到胸骨柄間作5～8 mm長的頸部正中切口，游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及伴行神經(jīng)，微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血15 min，然后松開微動(dòng)脈夾，恢復(fù)血液灌注15 min，如此反復(fù)3次造成小鼠腦缺血再灌注損傷。以觀察到小鼠出現(xiàn)驚厥、呼吸深慢、心跳加快為腦缺血模型成功的標(biāo)志。假手術(shù)組除不夾閉頸總動(dòng)脈外，其余操作同模型組。治療組在處死前7 d給予松樹皮提取物OPCs(100 mg/kg)灌胃治療，每日1次。正常對照組、假手術(shù)組、模型組用等量生理鹽水灌胃。

1.4 學(xué)習(xí)記憶能力測試

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)水池，平臺距液面1 cm。將水池分為NE、SE、SW、NW四個(gè)象限，水溫為25 ℃。定位航行實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)能力：每次將小鼠放入水池中(不放平臺)自由游泳60 s 使其熟悉迷宮環(huán)境，實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)5 d，每天訓(xùn)練4次(固定時(shí)間段)；將平臺固定放置于NW象限中間，從池壁四個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水池。記錄小鼠找到平臺的時(shí)間(逃避潛伏期)，4次訓(xùn)練均將小鼠分別從4個(gè)不同的起始點(diǎn)(不同象限)放入水中；小鼠找到平臺后，在平臺上休息30 s再進(jìn)行下一次試驗(yàn)；60 s內(nèi)找不到平臺的小鼠，則由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺，同樣休息30 s后再進(jìn)行下一次試驗(yàn)，潛伏期記為60 s；統(tǒng)計(jì)第5天小鼠4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為其學(xué)習(xí)成績?？臻g探索實(shí)驗(yàn)檢測小鼠記憶能力：定位航行試驗(yàn)結(jié)束后將撤除平臺，將所有小鼠于同一點(diǎn)(任選某一象限中點(diǎn))面對池壁放入水中，記錄 60 s內(nèi)小鼠穿越原平臺所在象限時(shí)間作為評估指標(biāo)[4]。

1.5 取材

腦缺血再灌注后第14、28天每組分別處死10只小鼠。每組取8只小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉、處死、灌注固定，用于HE染色；腦缺血再灌注后第14、28天每組取出2只小鼠缺血側(cè)大腦海馬組織，切成約1 mm3小塊，行透射電鏡觀察并攝片。

1.6 HE染色

各組腦組織在左側(cè)大腦半球距離嗅球尖端7～11 mm之間冠狀切取約5 mm厚腦組織塊，固定、脫水、包埋成蠟塊，連續(xù)切片，厚5 μm，常規(guī)行HE染色，觀察病理形態(tài)學(xué)改變。

1.7 海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的觀察

每組取出海馬組織塊放入2.5%戊二醛固定24 h，1%鋨酸后固定2 h，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，半薄切片定位，超薄切片，鈾染，鉛染，利用FEI-TECNAI10透射電子顯微鏡觀察并攝片，以觀察海馬超微結(jié)構(gòu)變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠腦組織病理變化

海馬區(qū)腦組織病理學(xué)染色(200倍光學(xué)顯微鏡下)顯示：假手術(shù)組排列整齊，可見有淺染的突起(圖1A)；與假手術(shù)組比較，14 d模型組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列稀疏，胞體形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞壞死，胞漿著色淺，胞核移位(圖1B)。OPCs治療組尼氏體排列不規(guī)律，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿著色相對較淺，但比模型組好(圖1C)。

A為假手術(shù)組，B為14 d模型組，C為14 d治療組

2.2 學(xué)習(xí)記憶能力

在定位航行實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組與正常對照組結(jié)果無差異(P>0.05)，14 d、28 d模型組小鼠逃避潛伏期明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)28 d模型組小鼠成績優(yōu)于14 d小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第14、28 d治療組小鼠需要更少的時(shí)間來找到隱藏于水面之下的站臺，成績優(yōu)于同期模型組(P<0.05)。空間探索實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組與正常對照組結(jié)果無差異(P>0.05)，與假手術(shù)組相比，14 d和28 d模型組小鼠穿越原平臺所在象限時(shí)間明顯降低(P<0.05)，表明其記憶能力明顯降低，其中14 d模型組降低更明顯；與同期模型組相比治療組記憶能力有所好轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

電鏡下，假手術(shù)組及正常對照組小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元胞核形態(tài)規(guī)則，核膜光滑、完整，染色質(zhì)分布均勻；胞漿細(xì)胞器豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布規(guī)則，表面附有較多的核糖體顆粒，線粒體發(fā)達(dá)，其表面雙層膜和內(nèi)部嵴清晰；細(xì)胞核及細(xì)胞器形態(tài)規(guī)則(圖2A-B)。14 d模型組海馬CA3區(qū)損傷嚴(yán)重，神經(jīng)元胞體水腫，出現(xiàn)核固縮溶解現(xiàn)象，電子密度增高，胞漿中存在細(xì)胞器溶解后形成的空泡，殘存線粒體膜破壞嚴(yán)重，線粒體嵴可見有斷裂 (圖2C)。28 d模型組海馬CA3區(qū)較14 d組比較有所恢復(fù)，神經(jīng)元胞體水腫減輕，電子密度增高，核膜邊界不清，間隙較大，染色質(zhì)電子致密度增高，細(xì)胞器較假手術(shù)組減少，線粒體腫脹，可見嵴斷裂，少量線粒體嵴消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊狀擴(kuò)張(圖2E)。14 d治療組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元較模型組受損減輕，胞體水腫現(xiàn)象減輕，細(xì)胞膜邊界欠清晰，細(xì)胞器數(shù)量增多，部分線粒體輕度腫脹，雙層膜結(jié)構(gòu)不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊狀擴(kuò)張(圖2D)；28 d治療組小鼠海馬CA3區(qū)同假手術(shù)組相比有一定差異，神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)較規(guī)則，電子密度相對較高，胞漿內(nèi)線粒體數(shù)量減少，偶見少量線粒體輕度腫脹(圖2F)，與28 d模型組比較細(xì)胞損傷有不同程度的減輕。

表1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Tab.1 Comparison of result of Morris water maze test

(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與14 d模型組比較，P<0.05；(3)與28 d模型組比較，P<0.05

A為正常對照組；B為假手術(shù)組；C為14 d模型組；D為14 d治療組；E為28 d模型組；F為28 d治療組

3 討論

腦組織缺血將會導(dǎo)致局部腦組織及其功能的損害，其損害程度與缺血時(shí)間長短及殘存血流量多少有關(guān)，短期不完全性缺血只引起可逆性損害，而長時(shí)間的完全缺血或嚴(yán)重缺血會引起梗死。缺血后的血流恢復(fù)在某些情況下能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，恢復(fù)血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷，抑制再灌注損傷成為目前治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。大量的研究表明，OPCs為有效的抗氧化劑，且無毒，無致突變性，無致癌性，無副作用[6]。

本研究采用了經(jīng)典生理實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮來研究腦缺血再灌注后小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，發(fā)現(xiàn)小鼠缺血再灌注后學(xué)習(xí)記憶能力下降，在14 d損傷較重，28 d后相對減輕，可能與小鼠的自身修復(fù)有關(guān)，同既往研究結(jié)果相一致[7]。本實(shí)驗(yàn)在給予原花青素治療7天后各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力有顯著提升，說明原花青素對缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善作用，王珠等[8]研究也發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素能改善腦缺血再灌注大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

本研究通過透射電鏡觀察到腦缺血再灌注損傷后小鼠海馬部位神經(jīng)元細(xì)胞核及胞漿內(nèi)細(xì)胞器發(fā)生了一系列病理改變。其中線粒體是細(xì)胞生物氧化的主要場所，當(dāng)線粒體受到損傷后可能引起細(xì)胞內(nèi)供能發(fā)生障礙，其結(jié)果將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，組織功能減退，其作用機(jī)制可能與缺血再灌注的直接作用、氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)凋亡等因素有關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)14 d模型組線粒體嵴破壞嚴(yán)重，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體，14 d治療組較模型組超微結(jié)構(gòu)有所好轉(zhuǎn)。近期研究表明原花青素能夠改善神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保護(hù)低氧大鼠避免進(jìn)一步腦損傷[10]。原花青素改善神經(jīng)細(xì)胞可能是抑制缺血再灌注損傷中核轉(zhuǎn)錄因子-кB的表達(dá)，阻斷核轉(zhuǎn)錄因子-кB誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)的反應(yīng)鏈，從而抑制細(xì)胞凋亡最終起到保護(hù)作用[11]。

此外，原花青素作為一種高效的抗氧化劑和自由基清除劑，能夠提高超氧化物歧化酶的活性，促進(jìn)一氧化氮的產(chǎn)生，并降低血清內(nèi)皮素的水平，從而發(fā)揮抗缺血再灌注損傷的作用；通過對炎癥因子表達(dá)的抑制，從而減輕腦缺血再灌注損傷[12]。因此，原花青素可能通過多種途徑保護(hù)腦缺血再灌注損傷腦組織，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(2015-01-29收稿，2015-03-08修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 劉 華

Protective Effects of Pine Bark Extract on Brain after Cerebral Ischemia-reperfusion in Mice

ZHANG Wenyan1,2, SUN Baofei1, YU Zijiang1, YU Yan1, XIAO Chaolun1, WANG Yulin1, LUO Shipeng1, LINGHU yan1

(1.DepartmentofAnatomy,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofRespiratory,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To explore the protective effect of procyanidin extracted from pine bark on hippocampus neurons of mice subjected to ischemia reperfusion brain injury. Methods: A total of 120 male Kunming mice were randomly divided into 6 groups, namely normal control group, sham operation group, 14-day model group, 28-day model group, 14-day treatment group and 28-day treatment group. The model of cerebral ischemia-reperfusion injury was constructed by bilateral carotid ligation ischemia for 15 minutes, and ischemia reperfusion for another 15 minutes. The treatment group was continuously given procyanidins by intragastric administration for 7 days before execution, and other groups were given the same amount of normal saline by intragastric administration. The change of memory capacity was observed in Morris water maze test. When mice were killed 14 and 28 days after model construction, the pathological changes of mice brain tissue were observed by HE staining method and the hippocampus ultrastructure was observed by transmission electron microscope. Results: The result of Morris water maze test showed that compared with model group, learning and memorizing ability in treatment group was improved to some extent. Compared with sham operation group, cells number in 14-day model group was significantly decreased, cytoplasmic staining was light and cell nucleus was tanslocated. In treatment group the tigroid body was arranged irregularly, some cells was in irregular shape and cytoplasmic staining was relatively light. However, the situation in treatment group was better than that in model group. In 14-day model group, hippocampus CA3 neurons of mice were seriously damaged, pericaryon was in edema, karyopyknosis dissolving phenomenon occurred, organelles dissolved and formed vacuole, the mitochondrial cristae fracture was broken, and the apoptotic bodies occurred in cells. In 28-day model group, some recovery could be found. In 14-day treatment group and 28-day treatment group, the above-mentioned situation in neuron improved compared with same period of other model group. Conclusion: The procyanidins extracted from pine bark has the function of protecting mice subjected to cerebral ischemia reperfusion injury.

pine bark extract; proanthocyanidins; reperfusion injury; hippocampus; microscopy, electron, scanning; cytoprotection

貴州省科技廳社會發(fā)展攻關(guān)黔科合SY字(2012)3144號

時(shí)間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1236.009.html

R743.9; R961

A

1000-2707(2015)05-0450-05

**通信作者 E-mail:yzj0112@126.com