蹇孝麗, 尹向飛, 胡恒貴, 蔣紅梅*

(1.貴陽醫(yī)學院 臨床微生物和免疫學教研室， 貴州 貴陽 550004；2.廈門市第二人民醫(yī)院 檢驗科， 福建 廈門 361021；3.蚌埠醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院 檢驗科， 安徽 宿州 234000)

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·基礎研究·

NF-κB寡核苷酸誘騙劑構建大鼠特異性耐受性樹突狀細胞*

蹇孝麗1**, 尹向飛2, 胡恒貴3, 蔣紅梅1***

(1.貴陽醫(yī)學院 臨床微生物和免疫學教研室， 貴州 貴陽 550004；2.廈門市第二人民醫(yī)院 檢驗科， 福建 廈門 361021；3.蚌埠醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院 檢驗科， 安徽 宿州 234000)

目的： 運用NF-κB寡核苷酸誘騙劑(NF-κB ODN Decoy)構建大鼠耐受性樹突狀細胞(dendritic cell,DC)，并將其負載牛Ⅱ型膠原(BⅡC)，對其成熟狀態(tài)進行評價。方法： 取SD大鼠脾臟單核細胞，用粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4誘導其轉化為DC后分成5組：單純DC組、脂多糖(LPS)DC組、Decoy-DC組、LPS刺激Decoy-DC組、負載BⅡC-Decoy-DC組，對終細胞進行形態(tài)觀察、評價活力、表型鑒定。結果： 大多數(shù)大鼠脾臟來源DC呈CD80+和CD86-的表型特征，各組大鼠DC特異性標志OX-62表達率>70%，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與單純DC組比較，Decoy-DC組細胞表面共刺激分子CD80和CD86陽性表達率和表達強度均呈明顯降低(P<0.05)，經LPS刺激后DC細胞CD80及CD86陽性表達率和表達強度上調均不明顯(P>0.05)；BⅡC-Decoy-DC組DC細胞形態(tài)學與Decoy-DC組無明顯差別，也同樣呈CD80和CD86低表達。結論： 用NF-κB ODN Decoy成功構建耐受性DC，此耐受性DC負載了特異性抗原BⅡC后表型穩(wěn)定。

樹突細胞；寡核苷酸類；牛Ⅱ型膠原；免疫耐受；大鼠，Sprague-Dawley

在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中，抗原遞呈功能的異常是非常重要因素。樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是體內最強的抗原遞呈細胞(APC)。近年來，未成熟的DC(immature DC,iDC)在誘導免疫耐受方面的作用引起了學者的廣泛關注[1-2]。有實驗證實NF-κB誘騙劑能阻斷NF-κB的活性，抑制DC的成熟[3]。本試驗擬用NF-κB寡核苷酸誘騙劑(NF-κB ODN Decoy)構建大鼠耐受性DC，并在體外負載牛Ⅱ型膠原(BⅡC)后，對DC形態(tài)學特征、表面共刺激分子表達情況進行評價，旨在構建有效、穩(wěn)定的大鼠特異性耐受性DC疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性SD大鼠，清潔級，7月齡，300 g左右，來源于貴陽醫(yī)學院實驗動物中心。大鼠NF-κB誘騙劑由上海生工生物工程公司合成。雙鏈NF-κB誘騙劑是由完全互補的正、反義硫代磷酸酯修飾的寡聚脫氧核苷酸混合于150 mmol/L NaCl中，加熱到100 ℃后冷卻到室溫而成。寡聚脫氧核苷酸的正義鏈序列為5′-AGG GAC TTT CCG CTG GGG ACT TTC-3′[4]；大鼠重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子recombinant rat GM-CSF，rr GM-CSF)、大鼠重組白細胞介素4(recombinant rat IL-4，rr IL-4)購自peprotech公司；PE標記的抗大鼠CD80和OX62單克隆抗體、FITC標記的抗大鼠CD86單克隆抗體均購自eBioscience公司；BⅡC、脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)購自sigma公司；流式細胞儀(BD FACSAriaTM)、熒光相差倒置顯微鏡(Nikon，TE2000-U型)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脾臟DC的分離與培養(yǎng) 取大鼠脾臟置無菌RPMI-1640培養(yǎng)液中，研磨脾臟獲取細胞懸液，200目濾網過濾，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，調整細胞密度為5×107/mL，按每孔3mL接種于6孔板，利用單核細胞貼壁的原理分離出單核細胞，用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸細胞至2.5 mL。臺盼藍染色計數(shù)細胞總數(shù)和活力。培養(yǎng)第3天每孔再加完全RPMI-1640培養(yǎng)液1 mL，并補足相應細胞因子，培養(yǎng)第6天將6孔板500 r/min離心10 min后，棄1.5 mL上清液再補足相應新鮮培養(yǎng)液和細胞因子。于第8天收獲各組細胞進行實驗，每孔可獲得(1.5～3.5)×106細胞，臺盼蘭染色測細胞活力>92%。

1.2.2 實驗分組 (1)單純DC組(Control-DC)：加入細胞因子直接誘導培養(yǎng)；(2)LPS-DC組：在用細胞因子直接培養(yǎng)第7天加入終濃度為10 mg/L的LPS繼續(xù)培養(yǎng)；(3)Decoy-DC組：在培養(yǎng)開始加入細胞因子同時加入大鼠NF-κB ODN Decoy，使其終濃度為5 μmol/L；(4)LPS刺激Decoy-DC組：在加入大鼠NF-κB ODN Decoy培養(yǎng)后第7天加入終濃度10 mg/L的LPS繼續(xù)培養(yǎng)；(5)負載BⅡC的Decoy-DC組(BⅡC-Decoy-DC)：在加入大鼠NF-κB ODN Decoy培養(yǎng)后第7天時加入BⅡC，使其終濃度為50 mg/L。

1.3 觀察指標

倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、流式細胞術檢測細胞表面分子OX62、CD80和CD86。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 體外誘導培養(yǎng)DC的形態(tài)特征

培養(yǎng)24 h內以貼壁細胞為主，48 h后約70%細胞懸浮，72 h補充細胞因子隔夜培養(yǎng)后有細胞集落形成，部分細胞體積明顯變大，呈星形或圓形，偶可見到毛發(fā)樣突起的細胞。培養(yǎng)5 d后，細胞大小不均，部分可見到明顯突起，懸浮細胞中典型毛發(fā)樣突起細胞稍多見，多數(shù)貼壁細胞可見細長偽足，Control-DC組比Decoy-DC組的貼壁細胞稍多，單純培養(yǎng)DC加入LPS后可見細胞長勢旺盛，細胞成片生長。培養(yǎng)8 d后LPS-DC組毛發(fā)樣突起細胞明顯多于其它組，而Decoy-DC組、LPS-Decoy-DC組、BⅡC-Decoy-DC組毛發(fā)樣突起細胞比較少見。另外，各組于第8天收獲細胞經臺盼藍染色后，未著色細胞比率均>92%。

2.2 細胞表面OX62的表達

各組DC表面OX62的表達均在70%以上，但各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 DC表面OX-62表達(流式細胞術)Fig.1 The detection data of OX-62 on DCs

2.3 細胞表面CD80和CD86分子的表達

Decoy-DC組、LPS-Decoy-DC組和BⅡC-Decoy-DC組細胞CD80陽性細胞率與Control-DC組比較有降低的趨勢， LPS刺激24 h后(即LPS-DC組)有所升高，但各組間相比未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Decoy-DC組和BⅡC-Decoy-DC組細胞CD80表達的平均熒光強度明顯低于Control-DC組(P<0.05)；Decoy-DC經LPS刺激后(LPS-Decoy-DC組)CD80表達有一定程度增高，但仍顯著低于LPS-DC組；LPS-DC組顯著高于其余4組(P<0.01)。Control-DC組幾乎不表達CD86，經LPS刺激24 h后CD86陽性細胞百分率有明顯升高(P<0.01)。Decoy-DC組、LPS-Decoy-DC組、BⅡC-Decoy-DC組與Control-DC組CD86陽性細胞百分率相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Control-DC、Decoy-DC、LPS-Decoy-DC和BⅡC-Decoy-DC組細胞表面CD86表達的平均熒光強度均很低，組間比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而LPS-DC組顯著高于其它組(P<0.01)。見圖2和表1。

3 討論

樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是一類重要的專職抗原提呈細胞(APC)，抗原提呈能力遠強于巨噬細胞、B細胞等其他APC，已經證實DC的不同成熟狀態(tài)有不同的免疫學功能， iDC由于低表達協(xié)同刺激分子CD80、CD86、CD40、CD56等，激活初始T細胞的能力很弱，導致T細胞的“無能”或低反應，從而誘導抗原特異性耐受，因而iDC被認為是一種耐受性DC[5-7]。核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一種轉錄調節(jié)因子，其活化對DC激活T細胞起著關健作用。誘騙寡核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide, decoy ODN)技術是近年來倍受關注的抗基因策略，已有人利用小鼠NF-κBODN Decoy處理小鼠骨髓來源單核前體誘導的DC細胞成功獲得了穩(wěn)定的耐受性DC[8]。鑒于大鼠在自身免疫病研究方面是一種非常重要的模型動物，本研究通過合成與NF-κB特異性結合位點(靶基因啟動區(qū))一致的寡核苷酸序列(NF-κB ODN Decoy)處理大鼠脾臟來源的DC，誘導獲得穩(wěn)定的特異性耐受性DC，用流式細胞術檢測細胞表面CD80和CD86的表達，結果顯示NF-κB ODN Decoy處理后的DC，其CD80的表達強度明顯低于Control-DC以及LPS-DC，CD86幾乎不表達，具有相對不成熟的細胞表型特征；且與Control-DC組在加入LPS后CD80和CD86的表達顯著增強相比，Decoy-DC組在經LPS刺激后，CD80和CD86陽性細胞比率和表達強度均沒有明顯增高。以上結果顯示，通過導入NF-κB ODN Decoy構建的耐受性DC具有穩(wěn)定的耐受表型。

注：A為CD80、CD86表達水平的散點圖，B為CD80表達水平的直方圖，C為CD80表達水平的直方圖

表1 各組DC表面CD80、CD86陽性表達率和平均熒光強度Tab.1 The positive expression rate and average fluorescence intensity of CD80 and CD86 on DCs in each group

(1)與Control-DC組比較P<0.05，(2)與LPS-DC組比較P<0.05

Ⅱ型膠原常被用來建立類風濕性關節(jié)炎的動物模型，建立的動物模型與人類風濕性關節(jié)炎表現(xiàn)最為相似[9]。獲得抗原特異性的耐受性DC疫苗，在DC培養(yǎng)體系中加入NF-κB ODN Decoy后第6天時，又加入BⅡC共孵至第8天，使其對BⅡC完成攝取和表達，制備負載了BⅡC的耐受性DC，稱為BⅡC-Decoy-DC。結果顯示，BⅡC-Decoy-DC形態(tài)與單純Decoy-DC無明顯區(qū)別，且負載BⅡC后細胞表面CD80和CD86的表達仍然保持與Decoy-DC相似的水平，負載抗原之后并未影響Decoy-DC表面CD80和CD86的相對低表達狀態(tài)，此結果有望將NF-κB ODN Decoy構建的耐受性DC負載BⅡC抗原后應用于BⅡC所致的大鼠RA模型研究，進一步在體內實驗中探討該疫苗的治療效果及機制。

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(2015-03-05收稿，2015-04-21修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 劉 華

Construction and Evaluation of Antigen-specific Tolerogenic Dendritic Cells Treated with Nuclear Factor-κB ODN Decoy

JIAN Xiaoli1， YIN Xiangfei2， HU Henggui3， JIANG Hongmei1

(1.DepartmentofClinicalMicrobiologyandImmunology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondPeople'sHospitalofXiamen,Xiamen361021,Fujian,China; 3.DepartmentofClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Suzhou234000,Anhui,China)

Objective: To construct the antigen-specific tolerogenic dendritic cell (DC) which was pre-treated with nuclear factor-κB (NF-κB) oligodeoxynucleotide (ODN) decoy and loaded with bovine collagen type Ⅱ(BⅡC) and evaluate cell maturity. Methods: Dendritic cells were generated by inducing rat spleen monocytes with recombinant GM-CSF and IL-4invitro. Those DC cells were divided into five groups: control DC group, LPS-DC group, Decoy-DC group, LPS stimulating Decoy-DC group and loaded with BⅡC Decoy-DC group. The cell morphology, cell vitality, cell phenotype were observed. Results: Most rat spleen-sourced DC cells showed CD80+/CD86- phenotype characteristics. The specific mark OX62 expression rate on the DC surface of each group was above 70%, there was no significant difference (P>0.05). Compared with control DC group, positive expression rate of costimulatory molecules CD80 and CD86 on the cell surface in Decoy-DC group decreased significantly (P<0.05). When stimulated by LPS, positive expression rate and intensity of CD80 and CD86 was not obviously increased (P>0.05). There were no obvious differences in cell morphology between BⅡC-Decoy-DC group and Decoy-DC group, and the low CD80 and CD86 expression in two groups could be observed.Conclusions: Tolerogenic DCs with low expression of costimulatory molecules (CD80 and CD86) are successfully constructed and the tolerogenic DCs loaded with BⅡC show stable cell phenotype.

dendritic cells; oligonucleotides; cattle collagen typeⅡ; immune tolerance; rats，Sprague-Dawley

貴州省科技廳貴陽醫(yī)學院聯(lián)合基金計劃項目資助合LG字(2012)004號)

時間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1238.010.html

R392

A

1000-2707(2015)05-0442-05

**貴陽醫(yī)學院2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:646117948@qq.com