孫 博， 張 弢， 楊 龍， 李 靖， 任厚相， 孫 琦， 王建吉， 葉 川*

(1．貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004；2．中國(guó)人民解放軍第117醫(yī)院 骨科， 浙江 杭州 311201)

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R-spondin1在促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用*

孫 博1**， 張 弢2， 楊 龍1， 李 靖1， 任厚相1， 孫 琦1， 王建吉1， 葉 川1***

(1．貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004；2．中國(guó)人民解放軍第117醫(yī)院 骨科， 浙江 杭州 311201)

目的： 研究Wnt信號(hào)通路激活劑R-spondin1在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSC)成骨分化中的作用。方法： 用0、5、10、20 μg/L R-spondin1處理hBMSC，利用熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)R-spondin1對(duì)hBMSC中Wnt信號(hào)通路的作用，Western blot檢測(cè)R-spondin1對(duì)Wnt信號(hào)通路下游靶基因β-catenin蛋白表達(dá)的影響；在成骨分化培養(yǎng)基中添加20 μg/L R-spondin1誘導(dǎo)hBMSC成骨分化，檢測(cè)R-spondin1對(duì)早期成骨分化指標(biāo)ALP活性及成骨分化晚期鈣沉積、成骨分化標(biāo)志物OSX 、OCN和成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2表達(dá)的影響。結(jié)果： R-spondin1增強(qiáng)hBMSC中Wnt信號(hào)通路，R-spondin1增強(qiáng)ALP活性和鈣沉積，促進(jìn)OSX、OCN及RUNX2的表達(dá)。結(jié)論： R-spondin1增強(qiáng)hBMSC中Wnt信號(hào)通路的作用，促進(jìn)hBMSC成骨分化。

R-spondin1；Wnt信號(hào)通路；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；RUNX2

骨缺損是臨床上常見(jiàn)的骨骼系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害患者的生活質(zhì)量。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSC)是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，在體外可定向分化為骨細(xì)胞，是骨再生工程理想的種子細(xì)胞，具有重要的臨床應(yīng)用前景[1]。R-spondins是一個(gè)在多種生物中廣泛表達(dá)的分泌蛋白家族，人類(lèi)RSPO家族包括四個(gè)家族成員，即R-spondin1、R-spondin2、R-spondin3和R-spondin4[2]。研究發(fā)現(xiàn)，R-spondins主要是通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)功能[3]。由于Wnt信號(hào)在骨發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)BMSC成骨分化，抑制成脂分化[4]。因此推測(cè)R-spondins在體外能夠通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路促進(jìn)人BMSC成骨分化。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究選取了R-spondins家族成員R-spondin1，檢測(cè)了其對(duì)人BMSC Wnt信號(hào)通路和成骨分化的作用。

1 材料方法

1.1 材料

TOPflash質(zhì)粒和pRL-SV40質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和RNA提取試劑TRIzol為Invitrogen公司產(chǎn)品，雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司，SYBR Premix ExTaq M定量PCR試劑為大連寶生物公司產(chǎn)品，β-catenin、RUNX2、OSX和OCN抗體購(gòu)自CST公司，Tubulin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所，茜素紅S(Alizrin Red S)為Sigma公司產(chǎn)品，α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。

1.2 BMSC的分離、培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)

經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和本人簽署知情同意書(shū)，hBMSC取自一位32歲健康男性志愿者，采用密度梯度離心法獲取hBMSC，并在加有雙抗的含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)使用第4代hBMSC。將hBMSC接種至孔板中，待細(xì)胞密度約60%時(shí)加入成骨誘導(dǎo)分化液(10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中加入10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、50 mg/L維生素C和0.1 μmol/L地塞米松)，每3 d換液一次。使用0、5、10、20 μg/L R-spondin1處理細(xì)胞，觀察其對(duì)Wnt信號(hào)通路的作用是否具有劑量依賴效應(yīng)。其余實(shí)驗(yàn)所用的R-spondin1濃度均為20 μg/L。

1.3 熒光素酶活性檢測(cè)

將hBMSC接種至12孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%左右時(shí)使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染TOPflash質(zhì)粒和pRL-SV40質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后使用20 μg/L的R-spondin1處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞后按照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性，每組樣品含有3個(gè)重復(fù)，相對(duì)熒光素酶活性為螢火蟲(chóng)熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.4 Western blot 分析

收集細(xì)胞，提取蛋白，蛋白定量后加入5×SDS沸水浴5 min，SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，使用5%的脫脂奶粉封閉，1 h后加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次后加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗，孵育2 h后用TBST 洗膜3 次，加入ECL發(fā)光劑顯色3 min后壓片顯影。

1.5 ALP活性檢測(cè)

BMSC成骨分化4 d，吸除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS洗2遍后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行ALP活性檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)出各孔吸光度值，同時(shí)采用BCA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總的蛋白量，用以校正 ALP 活性。重復(fù)3次。

1.6 鈣鹽沉積實(shí)驗(yàn)

hBMSC成骨分化14 d，棄去培養(yǎng)基后使用PBS洗2遍，戊二醛固定，使用ddH20清洗3次后加入0.4%茜素紅S，光鏡下觀察監(jiān)測(cè)，待出現(xiàn)紅色物質(zhì)堆積時(shí)棄去染液，使用ddH20終止反應(yīng)和洗滌，顯微鏡下拍照。為了定量檢測(cè)鈣鹽沉積，染色后加入冰乙酸在搖床上孵育30 min，刮下后于85 ℃水浴10 min，冰上5 min，高速離心后15 min，取400 加入10%NH4OH，將pH調(diào)到4.5后，用酶標(biāo)儀于405 nm處測(cè)吸光度值。

1.7 Real-time PCR

按TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR。Real-time PCR按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex Taq 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL，加H2O 7 μL補(bǔ)至20 μL，反應(yīng)在Applied Biosystems公司的7900HT Fast Real-time PCR system上進(jìn)行，每一樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參。RUNX2引物序列：Forward TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT、Reverse TGCTTTGGTCTTGAAATCACA。OSX引物序列：Forward CCTCCTCAGCTCACCTTCTC，Reverse GTTGGGAGCCCAAATAGAAA。OCN引物序列：Forward AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT，Reverse GCGCCTGGGTCTCTTCACT。GAPDH引物序列：Forward GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，Reverse GAGATGGTGATGGGATTTC。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 R-spondin1對(duì) hBMSC Wnt信號(hào)通路的影響

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示R-spondin1能夠以劑量依賴的方式激活Wnt信號(hào)通路，見(jiàn)圖1A。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示 R-spondin1能夠以劑量依賴的方式增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路下游靶基因β-catenin蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖1B。

注：A為熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果，B為Western blot 檢測(cè)結(jié)果

2.2 R-spondin1對(duì)hBMSC成骨分化的影響

R-spondin1顯著促進(jìn)了ALP活性，鈣沉積，見(jiàn)圖2。R-spondin1顯著促進(jìn)了OSX、OCN 和RUNX2 mRNA和蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖3。

注:A為ALP活性，B為鈣鹽沉積的定量，C為顯微鏡下鈣鹽沉積；(1)兩組比較，P<0.05

(1)兩組比較，P<0.05

3 討論

hBMSC是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，因其具有分離培養(yǎng)容易、增殖能力強(qiáng)和多向分化能力的優(yōu)點(diǎn)成為再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域研究最為深入的種子細(xì)胞之一。hBMSC是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在體外可以定向分化為骨細(xì)胞，其過(guò)程受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，包括BMPs/Smad、MAPK和Wnt信號(hào)通路等[5]。

Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典和非經(jīng)典2種。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路：即Wnt/β-catenin信號(hào)通路，Wnt配體(如Wnt3a)與受體FZD和輔助受體LRP結(jié)合后抑制APC復(fù)合物對(duì)β-catenin的降解，使β-catenin在細(xì)胞內(nèi)富集并入核與Tcf/Lef形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄[6]。非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路：Wnt配體(如Wnt11)與受體FZD和輔助受體ROR2/RYK結(jié)合后，激活下游JNK、CaMKII、PKC信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在hBMSC成骨分化過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用[7]。Qin等[4]發(fā)現(xiàn)使用Wnt3a激活經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，能夠顯著增強(qiáng)hBMSC中ALP活性，同時(shí)抑制脂滴形成，進(jìn)一步研究證實(shí)了經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路能夠通過(guò)促進(jìn)RUNX2的表達(dá)從而促進(jìn)hBMSC的成骨分化。研究發(fā)現(xiàn)在間充質(zhì)干細(xì)胞敲除β-catenin基因，能夠抑制成骨分化，進(jìn)一步說(shuō)明了經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在hBMSC成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[8]。Fu等[9]發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典Wnt/JNK通路也能促進(jìn)hBMSC的成骨分化能力。

R-spondin1是Wnt信號(hào)通路的激活劑，既能激活經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，也可以激活非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路[10]。由于經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在hBMSC成骨分化過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用，因此R-spondin1能夠促進(jìn)hBMSC的成骨分化能力。本研究結(jié)果證實(shí)了該推測(cè)，R-spondin1對(duì)早期成骨分化指標(biāo)ALP活性和成骨分化晚期鈣沉積都有顯著的增強(qiáng)作用，進(jìn)一步在分子水平上證明R-spondin1能夠促進(jìn)成骨分化標(biāo)志物OSX和OCN的表達(dá)，并初步證明對(duì)RUNX2表達(dá)的促進(jìn)作用可能是R-spondin1促進(jìn)hBMSC成骨分化的原因。

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(2015-03-23收稿，2015-04-19修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 周 凌

R-spondin1 Promotes Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

SUN Bo1， ZHANG Tao2， YANG Long1， LI Jing1， REN Houxiang1， SUN Qi1， WANG Jianji1, YE Chuan1

(1．GuiyangMedicalCollege，Guiyang550004，Guizhou，China; 2．DepartmentofOrthopedics,the117thHospitalofPLA,Hangzhou311201,Zhejiang,China)

Objective: To investigate the effect of R-spondin1, a Wnt signal pathway activator, on osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSC). Methods: hBMSC were treated with 0, 5, 10, 20 μg/L R-spondin1. Luciferase assay was employed to detect the effect of R-spondin1 on Wnt signal pathway, and Western blot was used to detect the expression of β-catenin which was the downstream target gene of Wnt signal pathway. Alkaline phosphatase(ALP) activity, calcium deposition, and the levels of OSX,OCN, RUNX2 were detected to observe the effect of R-spondin1 on hBMSC osteogenic differentiation. Results: R-spondin1 enhanced Wnt signal pathway, ALP activity, calcium deposition and the expression of OSX，OCN and RUNX2 in hBMSC osteogenic differentiation. Conclusion: R-spondin1 can enhance Wnt signal pathway of hBMSC and promote osteogenic differentiation.

R-spondin1；Wnt signal pathway；Human bone marrow mesenchymal stem cells；Osteogenic differentiation；RUNX2

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目[81360232]； 貴州省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目[gzwkj2010-1-042]； 貴州省國(guó)際科技合作項(xiàng)目[黔科合外G字2010-7]； 貴州省科技廳社發(fā)聯(lián)合基金項(xiàng)目[黔科合20103166]

時(shí)間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1226.004.html

R318.17

A

1000-2707(2015)05-0438-04

**貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2012級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:yechuanchina@hotmail.com