孫 博， 張 弢， 楊 龍， 李 靖， 任厚相， 孫 琦， 王建吉， 葉 川*

(1．貴陽醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004；2．中國人民解放軍第117醫(yī)院 骨科， 浙江 杭州 311201)

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·特約專論·

EPHA2在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用*

孫 博1**， 張 弢2， 楊 龍1， 李 靖1， 任厚相1， 孫 琦1， 王建吉1， 葉 川1***

(1．貴陽醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004；2．中國人民解放軍第117醫(yī)院 骨科， 浙江 杭州 311201)

目的： 研究EPHA2在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSC)成骨分化過程中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其在成骨分化中的作用。方法： hBMSC成骨分化誘導(dǎo)0、4、10和14 d后分別收集細(xì)胞提取RNA和蛋白， 采用Real-time PCR和Western blot方法檢測EPHA2 mRNA及蛋白表達(dá)；使用EPHA2的si-RNA下調(diào)EPHA2表達(dá)后進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，檢測下調(diào)EPHA2表達(dá)對早期成骨分化指標(biāo)ALP活性及晚期成骨分化指標(biāo)鈣沉積、成骨分化標(biāo)志物OSX 、OCN和成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2表達(dá)的影響。結(jié)果： EPHA2在hBMSC成骨分化過程中表達(dá)逐漸上升，下調(diào)EPHA2表達(dá)能抑制ALP活性和鈣沉積，抑制OSX、OCN及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的表達(dá)。結(jié)論： EPHA2在hBMSC成骨分化過程中表達(dá)逐漸上升，EPHA2可能通過增強(qiáng)RUNX2的表達(dá)從而促進(jìn)hBMSC成骨分化。

EPHA2；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；RUNX2

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSC)來源于發(fā)育早期的中胚層，是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞[1]。由于hBMSC獲取容易、易于體外培養(yǎng)和連續(xù)傳代，冷凍保存后仍具有多向分化潛能，使其成為理想的種子細(xì)胞廣泛用于再生醫(yī)學(xué)研究[2]。骨缺損是臨床上常見的骨骼系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重危害患者的生活質(zhì)量，以間充質(zhì)干細(xì)胞為細(xì)胞源的骨再生工程為這些患者帶來了新的希望。BMSC成骨分化受多種信號(hào)通路調(diào)控，最近的研究發(fā)現(xiàn)，ephrin-Eph信號(hào)通路在成骨分化中發(fā)揮著重要的作用[3]。在小鼠BMSC成骨分化過程中，ephrin-Eph信號(hào)通路配體ephrinA5/B1/B2和受體EPHA2/B2/B4/B6表達(dá)顯著上升[4]，該通路其它配體和受體在成骨分化特別是hBMSC成骨分化中的作用尚不清楚[5]。EPHA2是一個(gè)分子量為130 kDa的跨膜糖蛋白，能夠通過AKT、FAK、MAPK等多條信號(hào)通路促進(jìn)多種腫瘤的惡性進(jìn)展[6]。研究發(fā)現(xiàn)EPHA2在小鼠成骨細(xì)胞中表達(dá)，且在小鼠BMSC成骨分化過程中表達(dá)上升，提示其在成骨分化中可能發(fā)揮重要的作用[7]?；诖耍狙芯恳詇BMSC為模型，研究EPHA2在hBMSC成骨分化中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其在成骨分化中的作用。

1 材料方法

1.1 材料

α-MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，si-EPHA2、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，SYBR Premix ExTaq M定量PCR試劑為大連寶生物公司產(chǎn)品，EPHA2、RUNX2、OSX和OCN抗體購自CST公司，Tubulin抗體購自Santa Cruz公司，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒購自南京建成生物研究所，茜素紅S (Alizrin Red S)為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)

經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和本人簽署知情同意書，hBMSC取自一位32歲健康男性志愿者，采用密度梯度離心法獲取hBMSC，在加有雙抗的含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)使用的hBMSC均為第4代。成骨分化誘導(dǎo)時(shí)，將hBMSC接種至6孔板中，待細(xì)胞密度長至60%左右時(shí)加入成骨誘導(dǎo)分化液(10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中加入10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、50 mg/L維生素C和0.1 μmol/L地塞米松)，3 d換液1次。

1.3 Real-time PCR

在成骨分化的第0、4、10和14 天收集細(xì)胞，按TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR。Real-time PCR按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex Taq 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL，加H2O 7 μL補(bǔ)至20 μL，反應(yīng)在Applied Biosystems公司的7900HT Fast Real-time PCR system上進(jìn)行，每一樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參。EPHA2引物序列：Forward GGGACCTGATGCAGAACATC, Reverse AGTTGGTGCGGAGCCAGT。RUNX2引物序列：Forward TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT, Reverse TGCTTT

GGTCTTGAAATCACA。OSX引物序列：Forward CCTCCTCAGCTCACCTTCTC，Reverse GTTGGGAGCCCAAATAGAAA。OCN引物序列：Forward AGCAAAGGTGCAGCCTTTGT，Reverse GCGCCTGGGTCTCTTCACT。GAPDH引物序列：Forward GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，Reverse GAGATGGTGATGGGATTTC。

1.4 Western blot 分析

在成骨分化的第0、4、10和14 天收集細(xì)胞，提取蛋白，蛋白定量后加入5×SDS沸水浴5 min，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，然后使用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，1 h后加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，孵育2 h后用TBST 洗膜3 次，加入ECL發(fā)光劑顯色3 min后壓片顯影。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天接種細(xì)胞，使第2天細(xì)胞密度達(dá)到50%左右為宜。轉(zhuǎn)染前1 h更換不含血清和抗生素的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染時(shí)將稀釋的Lipofectamine 2000和siRNA(50 nmol/L)充分混勻室溫靜置20 min后加入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h后更換正常培養(yǎng)基，24 h后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化。

1.6 ALP活性檢測

hBMSC成骨分化第4天，吸除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS洗2遍后，按ALP試劑盒說明書進(jìn)行ALP活性檢測，用酶標(biāo)儀測出各孔吸光度值，同時(shí)采用BCA法檢測細(xì)胞內(nèi)總的蛋白量，用以校正ALP活性。每組樣品重復(fù)3次。

1.7 鈣鹽沉積實(shí)驗(yàn)

hBMSC成骨分化第14天，棄去培養(yǎng)基后使用PBS洗2遍，戊二醛固定后使用ddH20清洗3次后加入0.4%茜素紅S，光鏡下觀察，待出現(xiàn)紅色物質(zhì)堆積時(shí)后棄去染液，使用ddH20終止反應(yīng)和洗滌，顯微鏡下拍照。為了定量檢測鈣鹽沉積，染色后加入冰乙酸在搖床上孵育30 min，刮下后于85℃水浴10 min，冰上5 min，高速離心后15 min，取400 加入10%NH4OH，將pH調(diào)到4.5后，用酶標(biāo)儀于405 nm處測吸光度值，每組樣品重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPHA2在hBMSC成骨分化過程中的表達(dá)

Real-time PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，在hBMSC成骨分化過程中，EPHA2的mRNA及蛋白表達(dá)水平逐漸上升，見圖1。

注：A為Real-time PCR檢測結(jié)果，B為Western blot檢測結(jié)果

2.2 si-RNA下調(diào)hBMSC中EPHA2的表達(dá)

用EPHA2的si-RNA轉(zhuǎn)染hBMSC 48 h后收集細(xì)胞，EPHA2的 RNA和蛋白水平明顯下調(diào)，見圖2。

注：A為Real-time PCR檢測結(jié)果，B為 Western blot檢測結(jié)果；(1)兩組比較，P<0.05

2.3 EPHA2表達(dá)下調(diào)對hBMSC成骨分化的影響

在hBMSC成骨分化的第4天下調(diào)EPHA2表達(dá)顯著抑制了ALP活性，隨后在hBMSC成骨分化的第14天下調(diào) EPHA2表達(dá)顯著抑制了鈣沉積，見圖3。下調(diào)EPHA2的水平顯著抑制了成骨分化的標(biāo)志物OSX和OCN mRNA及蛋白的表達(dá)，見圖4。下調(diào)EPHA2的水平顯著抑制了成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2 mRNA及蛋白的表達(dá)，見圖4。

注：A為ALP活性，B為鈣鹽沉積的定量，C為顯微鏡下鈣鹽沉積；(1)兩組比較，P<0.05

(1)兩組比較，P<0.05

3 討論

Ephrin-Eph信號(hào)通路由配體Ephrin和受體Eph組成， 配體Ephrin表達(dá)在細(xì)胞膜，包含一個(gè)保守的胞外受體結(jié)合區(qū)，在人體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5種EphrinA配體(EphrinA1- EphfinA5)和3種EphrinB配體(EphrinB1-EphrinB3)；受體Eph連接酪氨酸激酶，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)組成，在人體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9種EphA受體(EphA1-EphA8和EphA10)及5種EphB受體(EphB1-EphB4和EphB6)[8]。由于配體Ephrin和受體Eph均位于細(xì)胞膜表面，因此細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用是啟動(dòng)Ephrin-Eph信號(hào)通路的主要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，Ephrin-Eph信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生和腫瘤發(fā)生過程中均發(fā)揮著重要的作用，最近越來越多的研究也表明Ephrin-Eph信號(hào)通路在骨發(fā)生和穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮著重要的作用[9]。研究表明，EphrinB2在破骨細(xì)胞中表達(dá)，而EphB4在成骨細(xì)胞中表達(dá)，成骨細(xì)胞中EphB4通過與破骨細(xì)胞中EphrinB2相互作用激活破骨細(xì)胞中的反式Ephrin-Eph信號(hào)通路從而抑制破骨細(xì)胞祖細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，而破骨細(xì)胞中EphrinB2通過與成骨細(xì)胞中EphB4相互作用激活成骨細(xì)胞中的順式Ephrin-Eph信號(hào)通路從而促進(jìn)成骨分化[10]。體外研究也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)EphrinB2能夠促進(jìn)成骨分化[11]。然而目前的研究主要集中在EphrinB配體和EphB受體在成骨分化中的作用，對于EphrinA配體和EphA受體在BMSC成骨分化中的作用研究很少，因此本實(shí)驗(yàn)研究了EPHA2在hBMSC成骨分化中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其在成骨分化中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在hBMSC成骨分化過程中，EPHA2的表達(dá)逐漸上升，提示其可能在hBMSC成骨分化過程中發(fā)揮重要作用。為了研究EPHA2在成骨分化中的作用，用si-RNA下調(diào)hBMSC中EPHA2的表達(dá)后進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，在成骨分化第4天， EPHA2的表達(dá)下調(diào)顯著抑制了早期成骨分化指標(biāo)ALP活性；在在成骨分化第14天，下調(diào)EPHA2的表達(dá)顯著抑制了晚期成骨分化指標(biāo)鈣沉積；進(jìn)一步在分子水平上發(fā)現(xiàn)下調(diào)EPHA2的水平能夠抑制成骨分化標(biāo)志物OSX和OCN及成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的表達(dá)，初步揭示了EPHA2調(diào)控hBMSC成骨分化的機(jī)制。本研究首次探索了EPHA2在hBMSC成骨分化中的作用，豐富了Ephrin-Eph信號(hào)通路在成骨分化中的作用研究，為hBMSC體外高效成骨分化提供了理論基礎(chǔ)。

[1] 王承云，石磊，夏春，等．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的改進(jìn)[J]．中國組織工程研究與臨床康復(fù)， 2011(32)：5896-5900．

[2] 李萍華，劉鈺瑜，崔燎．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨分化過程中Wnt信號(hào)通路的調(diào)控效應(yīng)[J]．中國組織工程研究與臨床康復(fù)， 2010(10)：1749-1754．

[3] 張新昌，張西正．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化相關(guān)通路的研究進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)綜述， 2013(21)：3853-3856．

[4] Fagotto F，Winklbauer R，Rohani N．Ephrin-Eph signaling in embryonic tissue separation[J]．Cell Adh Migr， 2014(4)：308-326．

[5] Sims NA．EPHs and ephrins：many pathways to regulate osteoblasts and osteoclasts[J]．IBMS BoneKEy， 2010(9)：304-313．

[6] 鄭俊青，安聰娟，方艷偉．EphA2/ephrinA1與人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的關(guān)系及靶向治療潛能探討[J]．中國腫瘤臨床， 2013(8)：486-488．

[7] Posthumadeboer J，Piersma SR，Pham TV，et al．Surface proteomic analysis of osteosarcoma identifies EPHA2 as receptor for targeted drug delivery[J]．Br J Cancer， 2013(8)： 2142-2154．

[8] 袁長永，朱紹躍，王鵬來，等．EphB4-EphrinB2通路的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J]．口腔醫(yī)學(xué)， 2014(6)：467-469．

[9] Klein R，Kania A．Ephrin signalling in the developing nervous system[J]．Current opinion in neurobiology， 2014(27)：16-24．

[10]Jin S，Yan Z，Tieyi Y，et al．Eph-ephrin bidirectional signalling：A promising approach for osteoporosis treatment[J]．Journal of Medical Hypotheses and Ideas， 2013(2)：40-42．

[11]Li Cl，Shi Cl，Kim J，et al．Erythropoietin promotes bone formation through EphrinB2/EphB4 signaling[J]．J Dent Res， 2015(5)：455-463．

(2015-03-09收稿，2015-04-25修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 周 凌

The Role of EPHA2 in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

SUN Bo1， ZHANG Tao2， YANG Long1， LI Jing1， REN Houxiang1， SUN Qi1， WANG Jianji1, YE Chuan1

(1．GuiyangMedicalCollege，Guiyang550004，Guizhou，China; 2．DepartmentofOrthopedics,the117thHospitalofPLA,Hangzhou311201,Zhejiang,China)

Objective: To investigate the dynamic changes of EPHA2 expression in the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenehymal stem cells(hBMSC) and the role of EPHA2 in the osteogenic differentiation. Methods: Cells were harvested on day 0, day 4, day 10 and day 14 during induction of osteogenic differentiation, RNA and protein was extracted and detected with Real-time PCR and Western blot analysis. siRNA for EPHA2 was used to silence the expression of EPHA2. Alkaline phosphatase (ALP) activity, calcium deposition, and the levels of OSX , OCN, RUNX2 were detected to observe the effect of EPHA2 on the osteogenic differentiation of hBMSC. Results: The expression of EPHA2 increased gradually in hBMSC osteogenic differentiation process. Down-regulation of EPHA2 inhibited ALP activity, calcium deposition and the expression of OSX, OCN and RUNX2 in hBMSC. Conclusions: The level of EPHA2 increases gradually in hBMSC osteogenic differentiation process, and EPHA2 can promote hBMSC osteogenic differentiation process through enhancing the expression of RUNX2.

EPHA2；human bone marrow mesenchymal stem cells；osteogenic differentiation；RUNX2

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360232)； 貴州省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(gzwkj2010-1-042)； 貴州省國際科技合作項(xiàng)目(黔科合外G字2010-7)； 貴州省科技廳社發(fā)聯(lián)合基金項(xiàng)目(黔科合20103166)

時(shí)間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1227.005.html

R318.17

A

1000-2707(2015)05-0433-05

**貴陽醫(yī)學(xué)院2012級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:yechuanchina@hotmail.com