胡雪鶴， 劉彩紅， 閻 浩， 祁 超

(華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北省遺傳與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430079)

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胸膜肺炎放線桿菌Δlip40回復(fù)突變株的構(gòu)建及鑒定

胡雪鶴*， 劉彩紅*， 閻 浩， 祁 超**

(華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北省遺傳與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430079)

胸膜肺炎放線桿菌(APP)可引起豬胸膜肺炎，在一定程度上阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展.目前，APP基因組中已得到有效鑒定的基因不足10%.為建立有效的APP功能基因研究體系，本文以前期構(gòu)建的血清1型APP SLW01株外膜脂蛋白基因缺失突變株Δlip40為親本，通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將攜帶有完整lip40基因的穿梭質(zhì)粒pJFF-lip40導(dǎo)入Δlip40中，通過(guò)氯霉素抗性篩選獲得回復(fù)突變株CΔlip40.對(duì)CΔlip40的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步分析發(fā)現(xiàn)，穿梭質(zhì)?？稍贏PP中穩(wěn)定遺傳，并且APP生長(zhǎng)能力未受穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入的影響.此外，SLW01和Δlip40對(duì)氯霉素高度敏感，但回復(fù)突變株CΔlip40較前兩種菌株對(duì)氯霉素抗性明顯增強(qiáng)，表明穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN抗性基因可在APP菌株中穩(wěn)定表達(dá).回復(fù)突變株CΔlip40的成功構(gòu)建為分析脂蛋白Lip40致病機(jī)制提供了有效對(duì)照材料，本研究中建立的互補(bǔ)菌株構(gòu)建系統(tǒng)以及APP抗性評(píng)價(jià)方法將有助于今后深入研究APP生物學(xué)特性及基因功能.

胸膜肺炎放線桿菌； 回復(fù)突變株； 構(gòu)建； 鑒定

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是一種革蘭氏陰性小球桿菌.該菌血清型較多，基于莢膜多糖抗原性，目前可將該菌劃分為15個(gè)血清型[1].此外，還可以根據(jù)對(duì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的依賴性分為非NAD-依賴的生物II型(血清型13、14)，和NAD-依賴的生物I型(血清型1-12、15)，所有血清型菌株都與豬致病相關(guān).APP 可引起豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，是一種接觸傳染性呼吸道疾病，通常表現(xiàn)為急性出血性、纖維素性、壞死性支氣管肺炎和纖維素性胸膜炎，感染該菌后，各年齡階段的豬都可能發(fā)病，該病給多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的養(yǎng)豬業(yè)都曾造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[2].該病于1957年由Pattison等[3]首次報(bào)道后，在世界范圍內(nèi)爆發(fā)和流行.研究表明，APP是一種多毒力因子病原菌，現(xiàn)已證明細(xì)菌毒素、莢膜多糖、脂多糖、粘附因子、蛋白酶、外膜蛋白以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等多種因子與該菌致病相關(guān)[4-7].

細(xì)菌脂蛋白(Lipoprotein，Lpp)是一類重要的功能蛋白，具有多種生理作用，如參與生物合成、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等[8].Lpp在病原菌致病過(guò)程中起重要作用，除可作為黏附分子和增加病原抗逆性外，還能調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答反應(yīng).另外，一些病原菌Lpp具有較好的免疫原性，是亞單位疫苗開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)[9].目前，人們對(duì)于多種常見(jiàn)人類疾病致病菌Lpp的生物學(xué)特性有了較多認(rèn)識(shí)，但對(duì)動(dòng)物病原菌APP Lpp的研究則相對(duì)較少.且之前對(duì)于APP Lpp的研究多側(cè)重于免疫原性及疫苗應(yīng)用研究，人們已經(jīng)克隆到一些具有良好免疫原性的脂蛋白，如TbpB[10]和多種OmlA[11-12]，證實(shí)具有疫苗應(yīng)用潛力，并成功開(kāi)發(fā)為疫苗(PleuroStar APP， Novartis Animal Health Inc.， Switzerland).

通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選到一個(gè)外膜脂蛋白基因lip40，隨后通過(guò)同源重組和負(fù)向篩選法成功構(gòu)建lip40基因缺失突變株Δlip40.本研究以Δlip40為親本菌株，通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法將攜帶有完整lip40基因的E.coli-APP穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入lip40基因缺失突變株Δlip40中，構(gòu)建回復(fù)突變株CΔlip40，并分析了該菌遺傳穩(wěn)定性、生長(zhǎng)能力以及氯霉素抗性，為進(jìn)一步分析Lip40的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 主要試劑

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.各種限制性內(nèi)切酶、LATaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker及pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程(大連)有限公司.DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司.胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白大豆肉湯(Tryptic soy broth，TSB)購(gòu)自美國(guó)Difco公司.

1.2 菌株、質(zhì)粒以及引物

血清1型胸膜肺炎放線桿菌SLW01為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室貝為成教授惠贈(zèng).胸膜肺炎放線桿菌lip40基因缺失突變株Δlip40由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存.大腸桿菌EscherichiacoliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存.穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN[13]由瑞士伯尼爾大學(xué)Joachim Frey教授惠贈(zèng).

擴(kuò)增lip40基因所用引物：

P1：5′-GGCTGCAGATGAAAAACATCACAAAATTTG-3′，含PstI酶切位點(diǎn)(見(jiàn)下劃線)；

P2：5′-TTGCGGCCGCTTACTTTTGTTGTTTTGCGC-3′，含NotI酶切位點(diǎn)(見(jiàn)下劃線).

APP菌株鑒定所用引物(tonB2基因)：

P3：5′-TTGGATCCGATGATTTACCCCAAGAAG-3′；

P4：5′-TTAAGCTTACCACTACCGCCTACCGC-3′.

穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN鑒定引物為：

P5：5′-GAATTTTACCCGGATTGACC-3′；

P6：5′-GCTGAAACTTTGCCATCGTA-3′.

1.3 APP基因組提取以及l(fā)ip40基因擴(kuò)增

取血清1型APP分離株SLW01的新鮮培養(yǎng)物，根據(jù)文獻(xiàn)[14]描述的方法提取APP基因組.以基因組為模板，通過(guò)引物P1和P2擴(kuò)增lip40基因.擴(kuò)增條件為：94℃ 10 min；94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10 min.

1.4 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

將前述PCR產(chǎn)物lip40基因連接到pMD18-T載體，得到質(zhì)粒pMD-lip40，經(jīng)酶切鑒定正確后，以PstI/NotI雙酶切，回收l(shuí)ip40片段并連接到經(jīng)同樣酶切的穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN中，得到攜帶外源基因的穿梭質(zhì)粒pJFF-lip40.

1.5 電轉(zhuǎn)化以及回復(fù)突變株的抗性篩選

大量制備質(zhì)粒pJFF-lip40，用電轉(zhuǎn)化將重組穿梭質(zhì)粒pJFF-lip40轉(zhuǎn)入基因缺失突變株Δlip40.APP電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行.電轉(zhuǎn)化參數(shù)：電壓2.5 kV，電容25 μFD，脈沖電阻800 Ω.電擊后將菌液置37℃恢復(fù)培養(yǎng)3 h后涂布抗性平板.氯霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆時(shí)，分別設(shè)置氯霉素濃度為2.5 μg/mL，2 μg/mL，1.5 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL.篩選具有氯霉素抗性的克隆，再用PCR加以驗(yàn)證.將得到的突變株命名為CΔlip40.

1.6 CΔlip40的遺傳穩(wěn)定性分析

將得到的回復(fù)突變株CΔlip40在不含氯霉素抗性的TSA培養(yǎng)基上傳代10次，之后涂布到不含氯霉素的TSA平板，隨機(jī)挑選10個(gè)單克隆，接種于無(wú)氯霉素的TSB培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，用PCR鑒定，以確定CΔlip40是否發(fā)生回復(fù).

1.7 CΔlip40的生長(zhǎng)能力分析

將過(guò)夜培養(yǎng)的SLW01、Δlip40、CΔlip40分別以1∶100的比例接種到100 mL TSB培養(yǎng)基中(含NAD和10%小牛血清)，接種后每隔1 h取樣一次，測(cè)定菌液在600 nm下的吸光值(OD600)，共測(cè)10 h，重復(fù)3次取平均值.比較3種菌株的生長(zhǎng)能力.

1.8 CΔlip40的氯霉素抗性分析

為了檢測(cè)SLW01、Δlip40、CΔlip40 3種菌株的氯霉素敏感性，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在第一列加入150 μL含NAD和10%小牛血清的TSB培養(yǎng)基，并將第一列氯霉素濃度設(shè)置為20 μg/mL，其后每孔加入75 μL培養(yǎng)基，從第一列培養(yǎng)基中取75 μL到第二列并進(jìn)行混勻，依次類推，將氯霉素依次進(jìn)行2倍稀釋.將過(guò)夜培養(yǎng)的SLW01、Δlip40、CΔlip40分別以1∶100的比例接種到TSB培養(yǎng)基中(含NAD和10%小牛血清)，待細(xì)菌生長(zhǎng)至OD600值為0.4～0.5時(shí)，用培養(yǎng)基(含NAD和10%小牛血清)進(jìn)行50倍稀釋，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入75 μL稀釋后的菌液于37℃搖床緩慢振蕩培養(yǎng).每隔1 h測(cè)定一次OD600值，共測(cè)7 h，重復(fù)3次取平均值.比較3種菌株對(duì)氯霉素的敏感性.

2 結(jié)果與分析

2.1 穿梭質(zhì)粒pJFF-lip40的構(gòu)建

以提取的APP基因組DNA為模板，以P1/P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1A所示，PCR產(chǎn)物大小約為900 bp，與預(yù)期大小相符(連同引物實(shí)際長(zhǎng)度為927 bp).將PCR擴(kuò)增的lip40基因克隆到pMD18-T載體中，序列分析證實(shí)無(wú)堿基誤配.將擴(kuò)增片段經(jīng)PstI和NotI酶切并插入到穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN的T4啟動(dòng)子下游.構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pJFF-lip40.經(jīng)PstI和NotI雙酶切后得到2條帶，大小約為8 000 bp和900 bp，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖1B).

(A) M：DNA marker;1：空白對(duì)照;2、3：lip40基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;(B) M：DNA marker;1：重組質(zhì)粒pJFF-lip40雙酶切(Pst I/Not I)產(chǎn)物.

2.2 回復(fù)突變株的篩選與初步鑒定

將穿梭質(zhì)粒pJFF-lip40以電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入血清1型lip40基因缺失突變株Δlip40中，當(dāng)氯霉素濃度為1 μg/mL時(shí)，有菌落生長(zhǎng)，隨機(jī)挑取克隆轉(zhuǎn)接至含氯霉素的TSB培養(yǎng)基，均可培養(yǎng)至渾濁，取培養(yǎng)物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，分別用3對(duì)引物加以驗(yàn)證：引物P1和P2用于擴(kuò)增lip40基因；引物P3和P4用于擴(kuò)增APP基因組中tonB2基因；引物P5和P6用于鑒定穿梭質(zhì)粒.PCR結(jié)果(圖2)均與預(yù)期相符，表明篩選的回復(fù)突變株初步證實(shí)是正確的.本次測(cè)試中隨機(jī)挑選的克隆均為陽(yáng)性，表明本實(shí)驗(yàn)體系能高效獲得APP回復(fù)突變株.

M:DNA marker.1～4：引物P3/P4驗(yàn)證結(jié)果.5：陽(yáng)性對(duì)照.6：空白對(duì)照.7～10：引物P5/P6驗(yàn)證結(jié)果.11：陽(yáng)性對(duì)照.12：空白對(duì)照.13～16：引物P1/P2驗(yàn)證結(jié)果.17：陽(yáng)性對(duì)照.18：空白對(duì)照.

2.3 CΔlip40的遺傳穩(wěn)定性

CΔlip40在不含氯霉素的TSA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次后，分別以引物P1/P2、P3/P4、P5/P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出特異性片段(圖3)，表明穿梭質(zhì)粒pJFF-lip40在APP菌株CΔlip40中穩(wěn)定存在，不需要額外添加氯霉素抗性選擇壓力.

(A) M:DNA marker;1：空白對(duì)照;2：陽(yáng)性對(duì)照;3～12：引物P3/P4驗(yàn)證CΔlip40 1～10代遺傳穩(wěn)定性結(jié)果;(B) M:DNA marker;1～10：引物P5/P6驗(yàn)證CΔlip40 1～10代遺傳穩(wěn)定性結(jié)果;11：陽(yáng)性對(duì)照;12：空白對(duì)照;(C) M:DNA marker;1：空白對(duì)照;2：陽(yáng)性對(duì)照;3～12：引物P1/P2驗(yàn)證CΔlip40 1～10代遺傳穩(wěn)定性結(jié)果.

2.4 CΔlip40體外生長(zhǎng)能力分析

APP野生型菌株SLW01、lip40基因缺失株Δlip40以及回復(fù)突變株CΔlip40的生長(zhǎng)曲線如圖4所示.可見(jiàn)回復(fù)突變株和親本菌株以及野生型菌株生長(zhǎng)能力差別不大，表明攜帶穿梭質(zhì)粒并沒(méi)有明顯影響APP的生長(zhǎng)速度.

圖4 SLW01、Δlip40以及CΔlip40體外生長(zhǎng)能力分析Fig.4 Growth ability of SLW01， Δlip40 and CΔlip40 in vitro

2.5 CΔlip40氯霉素抗性分析

SLW01、Δlip40以及CΔlip40在不同氯霉素濃度下的生長(zhǎng)曲線如圖5所示.當(dāng)氯霉素濃度≤0.31 μg/mL時(shí)，SLW01菌株與Δlip40菌株可以生長(zhǎng)，但在氯霉素濃度為1.24 μg/mL時(shí)，僅回復(fù)突變株CΔlip40可以生長(zhǎng)，可以判定穿梭質(zhì)粒CAT表達(dá)盒在CΔlip40中有效表達(dá).同時(shí)也說(shuō)明在回復(fù)突變株CΔlip40抗性篩選過(guò)程中，當(dāng)所選擇的氯霉素抗性濃度為1 μg/mL時(shí)，能夠高效獲得CΔlip40陽(yáng)性克隆，濃度過(guò)高(≥ 2 μg/mL)，無(wú)克隆生長(zhǎng)；而0.5 μg/mL則有較多假陽(yáng)性克隆.

(A) SLW01在不同氯霉素濃度下的生長(zhǎng)曲線;(B) Δlip40在不同氯霉素濃度下的生長(zhǎng)曲線;(C) CΔlip40在不同氯霉素濃度下的生長(zhǎng)曲線.

綜上所述，本研究以缺失外膜脂蛋白基因lip40的缺失突變株為親本菌株，成功將攜帶有完整lip40基因的穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN導(dǎo)入lip40基因缺失突變株中，構(gòu)建得到回復(fù)突變株CΔlip40.并且通過(guò)抗性篩選、遺傳穩(wěn)定性分析、生長(zhǎng)能力分析以及氯霉素抗性分析等一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)該回復(fù)突變株CΔlip40的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步分析.

3 討論

電轉(zhuǎn)化法是細(xì)菌、真菌等微生物導(dǎo)入外源基因的常用方法之一，尤其是采用化學(xué)或自然轉(zhuǎn)化法等傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法遇到困難時(shí)應(yīng)當(dāng)首選電轉(zhuǎn)化法[16].其原理是利用瞬間高壓電脈沖，使細(xì)胞的表面產(chǎn)生膜暫時(shí)性的孔道，同時(shí)由于電擊作用可促進(jìn)細(xì)胞膜融合，最后在細(xì)胞膜上產(chǎn)生大的孔道，易于質(zhì)粒DNA進(jìn)入[17].

基因敲除是研究細(xì)菌基因生物學(xué)功能及致病機(jī)理的重要方法，但在病原微生物的基因功能研究中，僅通過(guò)基因突變株表型變化還不夠，因?yàn)槟康幕蛳掠位虻霓D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能存在于上游目的基因中，目的基因缺失后可能產(chǎn)生極性效應(yīng)，導(dǎo)致其下游相鄰特別是相近基因轉(zhuǎn)錄水平改變，因而突變株的表型變化就不止是單個(gè)基因敲除所產(chǎn)生，而是由幾個(gè)相鄰基因共同變化所致.因此，通過(guò)構(gòu)建回復(fù)突變株，分析基因互補(bǔ)后的表型或基因功能是否恢復(fù)，可以有效驗(yàn)證目的基因的功能[18-19].

回復(fù)突變株常用的構(gòu)建方法包括質(zhì)粒法[20]以及基因原位整合法，質(zhì)粒法相較于原位整合法操作更加簡(jiǎn)單、快捷，并且原位整合法一般適用于質(zhì)粒在宿主菌株中不能穩(wěn)定存在或者不能有效表達(dá)時(shí)[21-22].用于構(gòu)建回復(fù)突變株的穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN最初由Frey構(gòu)建[13]，該質(zhì)粒以廣宿主性質(zhì)粒RSF1010為基礎(chǔ)而構(gòu)建[23-25]，部分研究表明該質(zhì)粒能在APP中拷貝，并攜帶II型氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因.雖然該基因在APP中表達(dá)效率遠(yuǎn)不及大腸桿菌(≥ 25 μg/mL)，但由于氯霉素在獸用領(lǐng)域禁用已久，許多APP分離株對(duì)氯霉素十分敏感，因此，不難獲得轉(zhuǎn)化子.另外，pJFF224-XN質(zhì)粒當(dāng)中還包含有T4噬菌體基因32的啟動(dòng)子區(qū)域以及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，能驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)[13].David等研究表明pJFF224-XN質(zhì)?？梢栽贏PP中高效的表達(dá)ApxI以及ApxII，證實(shí)了質(zhì)粒的啟動(dòng)子活性[26].

本研究還通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線的方法，比較了不同基因型APP菌株氯霉素敏感性.將對(duì)數(shù)中期APP菌株接種于不同氯霉素濃度液體培養(yǎng)基中，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的吸光值.結(jié)果表明，pJFF-lip40的表達(dá)使SLW01菌株獲得了一定的氯霉素抗性(1.24 μg/mL)，比不含質(zhì)粒菌株高4倍.當(dāng)篩選濃度為1.0 μg/mL時(shí)，隨機(jī)挑選克隆均呈穩(wěn)定氯霉素抗性；而當(dāng)篩選濃度下降至0.5 μg/mL時(shí)，TSA平板上部分轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR鑒定為APP，但無(wú)穿梭質(zhì)粒，為假陽(yáng)性克隆，但這樣的克隆轉(zhuǎn)接至0.5 μg/mLTSB培養(yǎng)基后不能生長(zhǎng)，此結(jié)果與通過(guò)生長(zhǎng)曲線法所得APP抗性濃度(≤ 0.31 μg/mL)符合.以上結(jié)果表明，生長(zhǎng)曲線法可用于初步分析APP抗生素抗性.

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的回復(fù)突變株CΔlip40可以作為lip40基因功能研究的有效對(duì)照，本研究中所使用的回復(fù)突變株構(gòu)建方法以及抗生素抗性分析法為后期深入研究APP功能基因及致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

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Construction and identification of complementation strain ofActinobacilluspleuropneumoniaemutant Δlip40

HU Xuehe， LIU Caihong， YAN Hao， QI Chao

(Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology，College of Life Sciences， Central China Normal University， Wuhan 430079)

Actinobacilluspleuropneumoniaeis the etiological agent of porcine pleuropneumonia (PCP)， which is associated with significant economic losses in swine industry worldwide. At present， the gene identification rate of APP genome is lower than 10%. To establish an effective research method for APP functional gene， an outer membrane lipoproteinlip40 gene deletion mutant of APP SLW01 (serovar 1)， was used as parent strain， named Δlip40. A shuttle vector containing intactlip40 gene (pJFF-lip40) was introduced into Δlip40 by electroporation， and through chlorampenicol resistance selection， complementation strain CΔlip40 was constructed. The preliminary analysis of biological characteristics of CΔlip40 was done. we found The shuttle vector was stable in CΔlip40， and the growth ability of CΔlip40 was not affected by the shuttle vector. Moreover， SLW01 and Δlip40 were highly sensitive to chloramphenicol while CΔlip40 had a stronger chloramphenicol resistance than the former two， indicating the resistance gene in pJFF224-XN stably expressed in the APP. CΔlip40 provided effective material for the analysis of pathogenesis of lipoprotein Lip40. The construction method of complementary strain and APP resistance evaluation method will be helpful for further investigating the biological characteristics and gene function of APP．

Actinobacilluspleuropneumoniae; complementation strain; construct; identification

2015-01-30.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20772040).

1000-1190(2015)04-0590-06

S852.61< class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

A

*并列第一作者.** 通訊聯(lián)系人.E-mail：qichao@mail.ccnu.edu.cn.