董易春，劉 超，王 曉，王雅春，張 毅，孫東曉，張勝利，張 勤，張 沅，俞 英

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

基于GWAS后分析策略研究TRAPPC9基因?qū)δ膛．a(chǎn)奶性狀的遺傳效應(yīng)

董易春，劉 超，王 曉，王雅春，張 毅，孫東曉，張勝利，張 勤，張 沅，俞 英*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

本研究基于課題組前期對北京地區(qū)中國荷斯坦牛群體產(chǎn)奶性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，在新的中國荷斯坦牛群中將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顆粒復(fù)合體9(TRAPPC9)基因作為產(chǎn)奶性狀的候選基因進(jìn)行遺傳效應(yīng)驗(yàn)證。研究利用混池測序?qū)ふ襍NPs位點(diǎn)，結(jié)合前期GWAS結(jié)果篩選到的SNPs位點(diǎn)，進(jìn)而分析這些多態(tài)性位點(diǎn)與中國荷斯坦牛產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNP1、SNP2位點(diǎn)對乳蛋白率和乳糖率效應(yīng)均顯著(P<0.05)；SNP3位點(diǎn)對乳脂率和乳蛋白率的效應(yīng)均極顯著(P<0.01)；SNP4位點(diǎn)對乳脂率有極顯著影響(P<0.01)；SNP5位點(diǎn)對乳脂率和乳糖率的效應(yīng)顯著(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TRAPPC9基因的表達(dá)量對產(chǎn)奶性狀也有顯著影響(P<0.05)，而TRAPPC9基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化對產(chǎn)奶性狀無直接顯著影響。該結(jié)果進(jìn)一步表明，TRAPPC9基因可以考慮作為分子遺傳標(biāo)記應(yīng)用于中國荷斯坦牛產(chǎn)奶性狀的標(biāo)記輔助選擇。

產(chǎn)奶性狀；TRAPPC9基因；SNP；DNA甲基化

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顆粒復(fù)合體9(Trafficking protein particle complex 9，TRAPPC9)基因位于奶牛14號染色體，編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顆粒復(fù)合體9蛋白也叫NIK及IKKβ結(jié)合蛋白(NIK and IKKβ-binding protein)，簡稱NIBP。NIBP具有參與NF-κB信號通路激活的過程、參與膜泡運(yùn)輸、參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的囊泡轉(zhuǎn)移和參與神經(jīng)細(xì)胞的分化等功能[1-2]。NF-κB信號通路在乳房炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3]，而NIBP能夠與激酶NIK和IKKβ相互作用，促進(jìn)NF-κB信號通路的激活[4-5]。

本課題組前期利用Illumina公司Bovine 50K芯片對北京地區(qū)中國荷斯坦奶牛群體2 093頭泌乳牛的產(chǎn)奶性狀和乳房炎抗性分別進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome wide association study，GWAS)，發(fā)現(xiàn)在奶牛TRAPPC9基因上存在6個(gè)顯著SNPs位點(diǎn)，其中ARS-BFGL-NGS-100480與產(chǎn)奶量、乳蛋白量、乳脂率[6-7]以及乳房炎抗性[8]關(guān)聯(lián)顯著，ARS-BFGL-NGS-56327、UA-IFASA-5306、UA-IFASA-5765、ARS-BFGL-BAC-25166和 Hapmap27703-BTC-053907與乳脂率關(guān)聯(lián)顯著[6-7]。因此，將TRAPPC9基因作為奶牛產(chǎn)奶性狀和乳房炎抗性潛在候選基因。

自2005年R.J.Klein等[9]首次通過GWAS方法對年齡相關(guān)的視網(wǎng)膜黃斑變性綜合征進(jìn)行研究以來，至今已有1 000多篇關(guān)于人類復(fù)雜疾病的一系列GWAS報(bào)道[10]。在奶牛上，目前也有很多國家報(bào)道了奶牛多個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀的GWAS結(jié)果[11-12]。然而，GWAS僅僅找到了對表型影響顯著的變異，卻沒法解釋這些變異是如何影響表型的變化。2010年，美國多個(gè)研究機(jī)構(gòu)基于人類癌癥GWAS結(jié)果實(shí)施“post-GWAS”項(xiàng)目，標(biāo)志著GWAS后分析策略時(shí)代的到來。GWAS后分析策略是指從基因組序列、表觀遺傳學(xué)、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)豐度、信號通路、細(xì)胞組織模型等方面來解釋這些顯著變異影響表型的生物學(xué)機(jī)制[10,13]。目前，在人類復(fù)雜疾病上已經(jīng)開展很多GWAS后分析策略的研究[14-15]，而在奶牛上的相關(guān)報(bào)道甚少。本研究基于課題組前期GWAS結(jié)果，在新的中國荷斯坦牛群體中將TRAPPC9基因作為產(chǎn)奶性狀的候選基因進(jìn)行遺傳效應(yīng)驗(yàn)證，并從mRNA和DNA甲基化水平對其影響產(chǎn)奶性狀的分子機(jī)制進(jìn)行探索，確定其能否作為可靠的分子遺傳標(biāo)記應(yīng)用于奶牛產(chǎn)奶性狀的標(biāo)記輔助選擇。

1 材料方法

1.1 材料

本研究以中國北方地區(qū)6個(gè)牛場514頭具有完整DHI、年齡及胎次等生產(chǎn)數(shù)據(jù)，飼養(yǎng)管理水平一致的中國荷斯坦牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)采集奶樣和血樣。采集的奶樣送至北京奶牛中心進(jìn)行DHI測定，獲得乳脂率、乳蛋白率、乳糖率以及體細(xì)胞數(shù)等表型數(shù)據(jù)。本研究中所有引物均與課題組前期研究[16]一致，故不再展示。

1.2 方法

1.2.1 血液DNA提取 血液樣品的DNA提取利用天根血液組織提取試劑盒提取，TB緩沖液溶解后，利用NANODROP2000紫外分光光度計(jì)和凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，將檢測合格的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2TRAPPC9多態(tài)性位點(diǎn)測序篩選 參照牛TRAPPC9基因序列(Gene ID：533451)，結(jié)合課題組前期的研究進(jìn)展在TRAPPC9基因啟動(dòng)區(qū)和GWAS分析顯著SNP位點(diǎn)附近分別設(shè)計(jì)引物，隨機(jī)挑選20頭奶牛的基因組DNA，等量混合為池DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，將合格的PCR產(chǎn)物送往華大公司進(jìn)行測序，確定SNP位點(diǎn)。

1.2.3 SNP分型 將上一步確定的SNP利用ABI公司的Multiplex SnaPshot 微測序技術(shù)進(jìn)行SNP分型。主要步驟：①引物設(shè)計(jì)：由于待分型的多個(gè)核酸片段需要在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，因此需對目的SNPs進(jìn)行多重PCR設(shè)計(jì)，每個(gè)SNP設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增引物和1個(gè)延伸引物；②多重PCR擴(kuò)增；③PCR產(chǎn)物純化：取3 μL PCR產(chǎn)物用ExoI和FastAP純化，其中ExoI用來去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，F(xiàn)astAP用來去除反應(yīng)中剩余的dNTP；④延伸反應(yīng)：純化后預(yù)先混好延伸引物，進(jìn)行延伸反應(yīng)；⑤測序取1 μL延伸產(chǎn)物，加10 μL上樣緩沖液，95 ℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 血液總RNA利用百泰克血液總RNA提取試劑盒進(jìn)行提取，RNase free ddH2O溶解后，利用NANODROP2000紫外分光光度計(jì)和凝膠電泳檢測RNA提取質(zhì)量，檢測合格的RNA通過TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 基因表達(dá)量檢測 本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)方法來檢測TRAPPC9基因的表達(dá)量，GAPDH作為內(nèi)參基因，采用的試劑盒和儀器分別為Roche公司的LightCycler?480 SYBR GreenⅡMaster和LightCycler?480。利用2-ΔΔCt相對定量分析法對TRAPPC9基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。1.2.6 基因組DNA處理和PCR擴(kuò)增 將基因組DNA用亞硫酸氫鹽進(jìn)行處理，使基因組中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，然后使用ZYMO Premix進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)總體系為40 μL，其中Premix 20 μL，ddH2O 14 μL，上游引物(10 μmol·L-1)1 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.1 μL，通用引物0.9 μL，處理后的DNA模板4 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸35 s，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；其中退火溫度為每對引物經(jīng)梯度PCR所確定的最適退火溫度。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行下一步的測序。

1.2.7 基因組DNA甲基化水平檢測 本研究利用QIAGEN公司的焦磷酸測序儀對上一步獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA甲基化水平定量檢測，同時(shí)利用該公司提供的Pyro Q-CpG軟件進(jìn)行測序Assay設(shè)計(jì)及相關(guān)參數(shù)設(shè)定。試驗(yàn)步驟參照本課題組前期研究報(bào)道[17-18]，測序完成后，利用Pyro Q-CpG軟件分析出測序結(jié)果，從而獲得待測樣品DNA甲基化水平數(shù)據(jù)，并利用克隆測序?qū)Y(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析TRAPPC9基因SNP對產(chǎn)奶性狀的遺傳效應(yīng)利用SAS9.1的MIXED過程進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，模型：y=μ+hys+p+m+h+g+a+e，其中，y為表型值，μ為群體均值，hys為場年季效應(yīng)，p為胎次效應(yīng)，m為泌乳階段效應(yīng)，h為健康狀態(tài)效應(yīng)，g為基因型效應(yīng)，a為個(gè)體隨機(jī)加性遺傳效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。其中健康狀態(tài)劃分標(biāo)準(zhǔn)：等級1：SCC≤20×104·mL-1；等級2：20×104·mL-1

2 結(jié) 果

2.1 SNP分型結(jié)果

在中國荷斯坦牛TRAPPC9基因啟動(dòng)子區(qū)和GWAS關(guān)聯(lián)顯著位點(diǎn)處設(shè)計(jì)引物，對池DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增進(jìn)行測序(圖1-圖3)。測序結(jié)果共發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs(表1和圖4所示)，其中4個(gè)為T/C突變(圖1A)，1個(gè)為T/G突變(圖1B)。如圖4所示，SNP1位于基因的啟動(dòng)子區(qū)，TFSEARCH軟件預(yù)測其為3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，SNP2位于外顯子上，SNP3位于內(nèi)含子上，SNP4和SNP5則分別為課題組前期GWAS報(bào)道顯著的位點(diǎn)ARS-BFGL-NGS-100480和Hapmap27703-BTC-053907。利用Multiplex SnaPshot 微測序技術(shù)對發(fā)現(xiàn)的5個(gè)SNPs進(jìn)行分型，圖2為TRAPPC9基因上SNP3(T2525852G)的SnaPshot分型結(jié)果示例，由于微測序采用的是反向引物，故圖2A、2B、2C分別代表GG、GT和TT基因型。

利用Excel統(tǒng)計(jì)TRAPPC9基因上述5個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，分析結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明這5個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表1TRAPPC9基因5個(gè)SNPs信息表

Table 1 Information of SNPs inTRAPPC9 gene

SNP位置Location物理位置(Btau_4.6.1)Physicallocation突變MutationSNP1啟動(dòng)子區(qū)2477531C-TSNP2第2外顯子2484891C-TSNP3第6內(nèi)含子2525852T-GSNP4第16內(nèi)含子2607583T-CSNP5第20內(nèi)含子2833449T-C

圖1 TRAPPC9基因SNP1(A)和SNP3(B)正向測序圖Fig.1 SNP1(A) and SNP3(B) of TRAPPC9 gene identified by frontal sequencing

圖2 T2525852G位點(diǎn)SnaPshot微測序峰圖Fig.2 SnaPshot sequencing of T2525852G site

表2 中國荷斯坦牛TRAPPC9等位基因頻率和基因型頻率

Table 2 Genotypic frequency and allele frequency ofTRAPPC9 gene in Chinese Holsteins

SNP基因型頻率Genotypicfrequency等位基因頻率AllelefrequencyAAABBBABχ2P值P-valueSNP1C2477531T0.370.500.130.620.380.970.33SNP2C2484891T0.960.040.000.980.020.160.69SNP3T2525852G0.150.510.340.410.592.060.15SNP4T2607583C0.340.520.140.600.401.710.19SNP5T2833449C0.160.440.400.620.381.150.28

2.2TRAPPC9基因SNP與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)

表3所示為TRAPPC9基因SNPs不同基因型對中國荷斯坦牛產(chǎn)奶性狀的影響?？梢奡NP1位點(diǎn)對乳蛋白率和乳糖率的效應(yīng)顯著(P<0.01)，CT型的乳蛋白率極顯著低于TT型，而CT基因型的乳糖率則極顯著高于CC和TT型(P<0.01)；SNP2位點(diǎn)對乳蛋白率和乳糖率的影響顯著(P<0.05)，其中CC基因型的乳蛋白率顯著低于CT型；SNP3位點(diǎn)對乳脂率和乳蛋白率的效應(yīng)均極顯著(P<0.01)，其中TT和GG基因型的乳脂率極顯著高于TG型，TT基因型的乳糖率極顯著高于TG型；SNP4位點(diǎn)對乳脂率的效應(yīng)極顯著(P<0.01)，其中CC型極顯著高于TC和TT型，TT基因型極顯著高于TC型；SNP5位點(diǎn)對乳脂率和乳糖率的效應(yīng)顯著(P<0.05)，其中CC基因型的乳脂率顯著高于CT型，CC基因型的乳糖率極顯著高于CT型。

2.3TRAPPC9基因表達(dá)量與產(chǎn)奶性狀的關(guān)系

表3TRAPPC9基因SNPs與產(chǎn)奶性狀關(guān)聯(lián)分析(最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

Table 3 Associations of SNPs ofTRAPPC9 gene with milk production traits in Chinese Holsteins(LSM±SE)

SNP基因型Genotype乳脂率/%Fatpercentage乳蛋白率/%Proteinpercentage乳糖率/%LactosepercentageSNP1CC3.29±0.073.29±0.034.50±0.04ACT3.35±0.063.23±0.02A4.61±0.03BTT3.26±0.103.34±0.04B4.45±0.05AP值0.54270.00700.0011SNP2CC3.32±0.063.27±0.02a4.54±0.03aCT2.35±0.134.16±0.08b3.75±0.09bP值0.15340.01690.0357SNP3TT3.64±0.08A3.35±0.03A4.53±0.04TG3.10±0.06B3.23±0.02B4.56±0.03GG3.57±0.07A3.27±0.034.57±0.04P值<0.00010.00020.6040SNP4CC3.78±0.10A3.35±0.044.58±0.05CT3.18±0.06B3.27±0.024.57±0.03TT3.46±0.07C3.29±0.024.56±0.04P值<0.00010.08380.8108SNP5CC3.38±0.05a3.32±0.03A4.59±0.04CT3.27±0.04b3.24±0.02B4.55±0.03TT3.31±0.063.25±0.034.52±0.05P值0.04620.00970.2835

a，b.同一組數(shù)據(jù)有不同上標(biāo)表示差異顯著(P<0.05)；A，B.同一組數(shù)據(jù)有不同上標(biāo)表示差異極顯著(P<0.01)

a，b.In the same row means significant difference between genotypes(P<0.05)；A，B.In the same row means significant difference between genotypes(P<0.01)

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，本研究中TRAPPC9基因的5個(gè)SNPs及其mRNA表達(dá)量對產(chǎn)奶性狀均有顯著影響。為了分析本研究中5個(gè)SNPs是否影響基因的表達(dá)，將上述40頭牛按照每種SNP的基因型分組進(jìn)行方差分析，最后發(fā)現(xiàn)SNP3不同基因型表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，多重檢驗(yàn)表明TT基因型的表達(dá)量顯著高于GT型(P<0.05，圖3D)，這與關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果相似。

2.4 TRAPPC9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與產(chǎn)奶性狀的關(guān)系

在TRAPPC9基因啟動(dòng)子區(qū)選擇2個(gè)區(qū)域進(jìn)行甲基化水平分析，如圖4所示的R1和R2區(qū)域，其中R1區(qū)域第3個(gè)CpG座位同時(shí)也為SNP1所在的位置，故該座位為CpG-SNP座位。

對同一地區(qū)2個(gè)牛場的155頭中國荷斯坦牛上述區(qū)域R1和R2進(jìn)行甲基化水平的分析，區(qū)域R1的甲基化水平如圖5所示，第1個(gè)CpG座位為100%甲基化；第2個(gè)CpG座位甲基化水平為100%；第3個(gè)座位為CpG-SNP，該座位為C→T的突變，其甲基化程度與SNP基因型有很大關(guān)系，當(dāng)其基因型為CC型時(shí)，其甲基化水平為100%，當(dāng)基因型為CT型時(shí)，其甲基化水平為60%，當(dāng)其基因型為TT型時(shí)，則不存在甲基化位點(diǎn)，其甲基化水平為0%，說明該區(qū)域的甲基化對產(chǎn)奶性狀的效應(yīng)等同于SNP1的效應(yīng)。

區(qū)域R2，由于該區(qū)域處于CpG島，CpG座位甲基化水平普遍較低。第1個(gè)CpG座位平均甲基化水平為6.81%；第2個(gè)CpG座位分兩類，一類為未甲基化，另一類為甲基化，其平均甲基化水平為5.97%；第3個(gè)CpG座位的平均甲基化水平為5.80%；第4個(gè)CpG座位的平均甲基化水平為6.29%。其中第1、3、4座位的甲基化水平在各個(gè)個(gè)體中幾乎沒有區(qū)別；第2個(gè)座位的甲基化水平為質(zhì)的變異，但其是否發(fā)生甲基化對產(chǎn)奶性狀并無顯著影響(表4)。

圖3 TRAPPC9基因表達(dá)水與產(chǎn)奶性狀的關(guān)系Fig.3 Relationship between expression of TRAPPC9 and milk production traits

圖4 TRAPPC9 SNP座位和甲基化區(qū)域示意圖Fig.4 SNP site and methylation region of TRAPPC9

圖5 TRAPPC9基因啟動(dòng)子區(qū)域1甲基化水平示意圖Fig.5 The methylation level of region 1 of TRCPPC9

3 討 論

目前，NCBI上已經(jīng)報(bào)道牛TRAPPC9基因上有3 000多個(gè)SNPs，其中28個(gè)SNPs在外顯子上[19-20]。本課題組前期進(jìn)行GWAS所使用的芯片僅覆蓋了其中的16個(gè)SNPs，且均在內(nèi)含子上。本研究在課題組前期結(jié)果的基礎(chǔ)上，增加了3個(gè)SNPs，分別位于基因的啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明這些SNP均與產(chǎn)奶性狀具有顯著關(guān)聯(lián)，其中SNP4和SNP5與乳脂率關(guān)聯(lián)顯著，這與課題組前期GWAS報(bào)道的結(jié)果[6-7]一致。本研究中，SNP3位點(diǎn)與乳脂率和乳蛋白率關(guān)聯(lián)均極顯著，前期研究[21]報(bào)道該位點(diǎn)與乳脂率和細(xì)胞因子IFN-γ關(guān)聯(lián)顯著。SNP2位點(diǎn)為位于第2外顯子上的錯(cuò)義突變，其中T等位基因頻率非常低，蛋白預(yù)測結(jié)果表明該突變?yōu)闊o害突變(圖6A)，同時(shí)預(yù)測發(fā)現(xiàn)該突變對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響(圖6B)，推測其結(jié)構(gòu)改變可能影響到奶牛的生產(chǎn)性能從而在育種選擇中被逐步淘汰。

表4 區(qū)域R2-2甲基化對產(chǎn)奶性狀的影響

Table 4 The effects of methylation status of region 2-2 CpG site on milk production traits

區(qū)域R2-2Region2-2乳脂率/%Fatpercentage乳蛋白率/%Proteinpercentage乳糖率/%Lactosepercentage未甲基化Unmethylation2.13±1.503.09±0.404.66±0.84甲基化Methylation2.35±2.193.15±0.504.75±1.05P值P-value0.520.440.59

mRNA水平分析表明，TRAPPC9基因表達(dá)量對乳脂率和乳糖率影響顯著，對乳蛋白率也有影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SNP3位點(diǎn)對TRAPPC9基因表達(dá)量影響顯著，而SNP3不僅僅與產(chǎn)奶性狀關(guān)聯(lián)顯著，同時(shí)也與乳房炎抗性關(guān)聯(lián)顯著。相關(guān)研究[16]表明TRAPPC9基因的表達(dá)量對乳房炎抗性影響顯著，W.H.Hu等[22]報(bào)道TRAPPC9基因的過表達(dá)能夠增強(qiáng)TNF-α激活NF-κB信號通路。

TRAPPC9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)分析表明區(qū)域R1的甲基化效應(yīng)等同于SNP1的效應(yīng)，T.A.Dayeh等[23]對與2型糖尿病相關(guān)的16個(gè)基因的19個(gè)CpG-SNP進(jìn)行研究，結(jié)果表明，這些SNP對2型糖尿病的效應(yīng)可能通過這種差異的甲基化狀態(tài)所引起。區(qū)域R2的甲基化水平對奶牛的產(chǎn)奶性狀影響不顯著，相關(guān)研究[16,24]表明，該位點(diǎn)的甲基化水平對奶牛乳房炎抗性影響顯著。

本研究中區(qū)域R1的甲基化狀態(tài)由SNP1所決定，同時(shí)該位點(diǎn)為3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，說明SNP1可能通過其對DNA甲基化產(chǎn)生影響，而DNA甲基化狀態(tài)的改變使DNA雙鏈的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，阻止甲基化敏感的轉(zhuǎn)錄因子(包括NF-κB、ETS和E2F等)結(jié)合到DNA上發(fā)揮作用，同時(shí)，對甲基化不敏感的轉(zhuǎn)錄抑制因子會結(jié)合到DNA上，最終影響基因的表達(dá)，從而對表型產(chǎn)生影響[25-26]。 在人和小鼠上的大量研究[1,4-5]表明，TRAPPC9基因編碼的蛋白NIBP對激活NF-κB信號通路具有重要作用，在牛上僅有一例研究TRAPPC9基因的報(bào)道[27]，其研究表明TRAPPC9基因編碼的蛋白NIBP與牛病毒性腹瀉病毒蛋白互作調(diào)節(jié)NF-κB通路，而NF-κB信號通路在乳房炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[28-30]，結(jié)合TRAPPC9基因的生物學(xué)功能，推測其可能通過對乳房炎抗性的影響間接影響到奶牛的產(chǎn)奶性狀。本研究中TRAPPC9基因SNP和mRNA表達(dá)水平對奶牛乳脂率影響極顯著，且SNP與前人GWAS研究報(bào)道一致。因此，可以考慮將其作為一個(gè)分子遺傳標(biāo)記應(yīng)用于中國荷斯坦牛的標(biāo)記輔助選擇。

圖6 SNP2位點(diǎn)蛋白質(zhì)預(yù)測結(jié)果Fig.6 Protein prediction of SNP2

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(編輯 郭云雁)

Confirming the Genetic Effects of BovineTRAPPC9 on Milk Production Traits Based on Post-GWAS Strategies

DONG Yi-chun，LIU Chao，WANG Xiao，WANG Ya-chun，ZHANG Yi，SUN Dong-xiao， ZHANG Sheng-li，ZHANG Qin，ZHANG Yuan，YU Ying*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

Based on the result of the previous genome-wide association study(GWAS) for milk production traits in Beijing Chinese Holstein population，trafficking protein particle complex 9(TRAPPC9) as a novel candidate gene for milk production traits was confirmed in new Chinese Holstein population.Promoter，exon and GWAS’s significant region was amplified and sequenced by screening the DNA pools to select single nucleotide polymorphisms(SNP) and analyze their association with milk production traits of Chinese Holstein population.The association analysis showed that the genotypes of SNP1 had significant effect on protein percentage(PP) and lactose percentge(LP)(P<0.01)；the genotypes of SNP2 had significant effect on PP and LP(P<0.05)；the genotypes of SNP3 had significant effect on fat percent(FP) and PP(P<0.01)；the genotypes of SNP4 had significant effect on FP(P<0.01)；the genotypes of SNP5 had significant effect on FP and LP(P<0.05).The expression ofTRAPPC9 also had significant effect on milk production traits，but the DNA methylation of promoter region ofTRAPPC9 had no direct effect.In conclusion，TRAPPC9 gene can be considered as a molecular marker applied to Chinese Holstein marker-assisted selection.

milk production trait；TRAPPC9 gene；SNP；DNA methylation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.008

2014-04-28

國家自然科學(xué)基金(31272420)；農(nóng)業(yè)部奶業(yè)體系項(xiàng)目(CARS-37-04B)；十二五國家科技支持項(xiàng)目(2011BAD28B02)；“863”重大項(xiàng)目(2008AA101002)；教育部基本科研項(xiàng)目(2011JS006)；長江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1191)

董易春(1990-)，男，江蘇人，碩士生，主要從事動(dòng)物分子數(shù)量遺傳學(xué)研究，E-mail：dongyichun.me@163.com

*通信作者：俞 英，副教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物分子抗病育種及表觀遺傳調(diào)控研究，E-mail：yuying@cau.edu.cn

S813.3；S823.91

A

0366-6964(2015)01-0060-09