劉延輝，夏淑軒，劉雅芳，柳垂亮，李玉娟△(中山大學(xué)附屬孫逸仙紀念醫(yī)院麻醉科，廣東廣州500;佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院麻醉科，廣東佛山58030)

·論著·

Cdk5-CRMP通路在七氟醚抑制新生大鼠前額葉皮層樹突發(fā)育中的作用*

劉延輝1，夏淑軒1，劉雅芳1，柳垂亮2，李玉娟1△
(1中山大學(xué)附屬孫逸仙紀念醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510120;2佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院麻醉科，廣東佛山528030)

目的:探究七氟醚對新生大鼠前額葉皮層(prefrontal cortex，PFC)樹突發(fā)育的影響及與細胞周期依賴性蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5，Cdk5) -坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(collapsin response mediator protein，CRMP)通路的關(guān)系。方法: 88只出生后7 d的SD大鼠隨機分為4組，每組22只:空白對照組(Air + NS組)，Cdk5抑制劑roscovitine(Ros)對照組(Air + Ros組)，Sevo + NS組，Sevo + Ros組。前2組吸入空氣，后2組吸入2. 8%七氟醚4 h。Air + Ros組和Sevo + Ros組在麻醉前15 min經(jīng)腹腔注射10 mg/kg的Cdk5抑制劑roscovitine。其余2組則在麻醉前15min經(jīng)腹腔注射150 μL生理鹽水。麻醉結(jié)束后，每組各取5只幼鼠，取出新鮮皮質(zhì)組織，Western blot檢測P35、P25、Cdk5，CRMP1、2、4的蛋白表達以及CRMP2 Ser 522的磷酸化水平。剩余幼鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，出生后30 d每組各取6只幼鼠，取腦進行高爾基染色，制備冰凍切片，鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)。其余幼鼠在出生后25～27 d進行曠場試驗，31～32 d進行情景依賴性恐懼記憶檢測。結(jié)果: (1)與Air + NS組比較，Sevo + NS組的P35減少了47. 32%，同時P25增加了173. 77%(P＜0. 05) ; Sevo + Ros組的P35比Sevo + NS組增加了78. 81%，其P25則減少了60. 22%(P＜0. 05)。Cdk5表達組間差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義。(2)與Air + NS組比較，Sevo + NS組的總CRMP1、2 和4表達分別下降了36. 22%、53. 74%和51. 28% (P＜0. 05)，同時p-CRMP2 Ser522/CRMP2比值增加了96. 20% (P＜0. 05) ; Sevo + Ros組的總CRMP1和4與Sevo + NS組比較分別增加了56. 95%和88. 91% (P＜0. 05)，而p-CRMP2 Ser522/CRMP2比值下降了43. 58% (P＜0. 05)。(3)與Air + NS組比較，Sevo + NS組的樹突總長度、第二級樹突長度以及60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點數(shù)均顯著下降(P＜0. 01)。Sevo + Ros組的樹突總長度、第二級樹突長度以及60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點數(shù)均比Sevo + NS組顯著增加(P＜0. 05)。(4)在恐懼記憶實驗中，與Air + NS組比較，Sevo + NS組大鼠的“木僵”時間比Air + NS組減少約21% (P＜0. 05)。Sevo + Ros組的“木僵”時間比Sevo + NS組顯著增加(P＜0. 05)。各組幼鼠在曠場實驗的結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:七氟醚抑制了新生大鼠前額葉皮層神經(jīng)元樹突的正常生長發(fā)育和幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力，而Cdk5-CRMP通路激活可能是七氟醚引起神經(jīng)發(fā)育毒性的機制之一。

七氟醚;前額葉皮層;細胞周期依賴性蛋白激酶5;坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of sevoflurane (Sevo) on the dendritic development in prefrontal cortex (PFC) of neonatal rats and the role of cyclin dependent kinase 5 (Cdk5) - collapsin response mediator protein (CRMP) pathway in it.METHODS: Eighty-eight postnatal day 7 Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups (n =22) : Air + NS group，Air + roscovitine (Ros) group，Sevo + NS group and Sevo + Ros group.The rats inAir + NS group and Air + Ros group were exposed to the air for 4 h，while the rats in the other 2 groups were exposed to 2. 8% sevoflurane for 4 h.The rats received intraperitoneal injection of 150 μL normal saline 15 min before exposure in the Air + NS group and Sevo + NS group，while the rats in the Air + Ros group and Sevo + Ros group received intraperitoneal injection of 150 μL roscovitine (in DMSO solution，10 mg/kg) 15 min before exposure.At the end of exposure，the cortices of the rat brain were collected and the protein levels of P35，P25，Cdk5，CRMP1，CRMP2，CRMP4 and p-CRMP2 Ser522 in PFC were detected by Western blot.On the postnatal day 30，the rat brains were sectioned for Golgi-Cox staining and morphological analysis of dendrites in the PFC neurons.Open-field test and contextual fear conditioning test were performed on postnatal days 25～27 and 31～32，respectively.RESULTS: Compared with Air + NS group，the expression of P35 in the Sevo + NS group was significantly decreased，and the expression of P25 was dramatically increased (P＜0. 05)，whereas roscovitine partly reversed the changes above induced by sevoflurane (P＜0. 05).The expression of Cdk5 was not significantly different among all groups.Compared with the Air + NS group，the expression of CRMP1，2，and 4 in the Sevo + NS group were decreased，and the protein level of p-CRMP2 Ser522/CRMP2 was increased (P＜0. 05)，whereas roscovitine partly reversed the changes above induced by sevoflurane (P＜0. 05)，except for the expression of CRMP2.Compared with Air + NS group，the total dendrite length，secondary dendritic length and interactions on 60 and 80 μm shells in the Sevo + NS group were decreased (P＜0. 01)，whereas roscovitine partly reversed the changes above induced by sevoflurane (P＜0. 05).Compared with Air + NS group，the percentage of freezing time in the Sevo + NS group was decreased (P＜0. 01)，whereas roscovitine partly reversed the changes induced by sevoflurane (P＜0. 05).No significant difference among groups in the open-field test was observed.CONCLUSION: Sevoflurane exposure disturbed dendritic development of neurons in PFC，learning and memory ability of neonatal rats，which may be mediated by Cdk5-CRMP pathway.

［KEY WORDS］Sevoflurane; Prefrontal cortex; Cyclin dependent kinase 5; Collapsin response mediator protein

七氟醚(sevoflurane，Sevo)是臨床常用的吸入麻醉藥。近年來有不少回顧性研究指出嬰幼兒時期接受多次手術(shù)與麻醉與學(xué)齡期學(xué)習(xí)記憶能力下降，注意力障礙和行為異常有關(guān)［1］。而且，3歲前接受過麻醉的兒童，在10歲時出現(xiàn)語言以及抽象理解思維障礙的風(fēng)險比未接受過麻醉的兒童更高［2］。動物和細胞研究提示，全麻藥引起認知功能障礙的機制，與其增加細胞內(nèi)鈣離子濃度，誘導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)干細胞凋亡［3-4］、抑制神經(jīng)細胞增殖［4］等有關(guān)。近期的研究發(fā)現(xiàn)，全麻藥還可干擾神經(jīng)元的突觸發(fā)育，降低突觸的密度和復(fù)雜性［5-6］。但全麻藥是通過哪些分子機制來影響突觸發(fā)育的，目前并不明確。

腦發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，神經(jīng)元的遷移，突起的延伸以及突觸的形成，這些過程正確有序地進行才能形成正常且有功能的神經(jīng)環(huán)路。坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(collapsin response mediator proteins，CRMPs)家族是調(diào)控神經(jīng)細胞突觸發(fā)育的重要分子，通過與細胞骨架如微管或微絲等相互作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的極化、樹突和軸突的生長、細胞變形和遷移等。CRMP的磷酸化受周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5，Cdk5)及糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)調(diào)控。Wang等［7］發(fā)現(xiàn)抑制過度激活的Cdk5通路有助于降低異氟醚暴露導(dǎo)致的新生大鼠神經(jīng)毒性。我們前期實驗也發(fā)現(xiàn)異氟醚顯著增加了新生大鼠海馬CRMP2磷酸化水平，提示異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)元的凋亡可能與增加CRMP2的磷酸化有關(guān)［8］。七氟醚對突觸發(fā)育的抑制是否與Cdk5-CRMP蛋白通路激活有關(guān)，目前尚無相關(guān)報道。

因此，本研究擬建立七氟醚處理新生幼鼠的模型，并采用Cdk5抑制劑預(yù)處理，研究七氟醚對前額葉皮層神經(jīng)元樹突發(fā)育的形態(tài)學(xué)影響，與樹突發(fā)育相關(guān)的CRMP蛋白家族表達的變化以及對大腦認知功能的改變，并進一步探討Cdk5-CRMP蛋白通路在七氟醚干擾樹突發(fā)育中的作用機制。

材料和方法

1材料

1.1儀器與試劑麻醉呼吸機(Ohmeda) ;氣體監(jiān)護儀(Datex) ; DM 6000熒光顯微鏡、冰凍切片機(Leica) ;曠場實驗檢測系統(tǒng)(Noldus information technology) ; STARTFEAR動物恐懼記憶檢測系統(tǒng)(Panlab) ; Cdk5抑制劑roscovitine(Ros;購自Selleck) ;七氟醚(雅培有限公司) ; p-CRMP2 Ser522多克隆抗體(ECM Biosciences) ; CRMP2多克隆抗體(CST) ; Cdk5抗體、CRMP1多克隆抗體、CRMP4多克隆抗體(Abcam) ;β-actin單克隆抗體(Santa Cruz) ; P35/P25抗體、羊抗兔Ⅱ抗、羊抗小鼠Ⅱ抗(上海碧云天生物技術(shù)公司) ; FD Rapid GolgiStainTMKit(FD NeuroTechnologies，Inc.)。

1.2動物與分組88只SPF級出生后7 d SD大

鼠，雌雄不限，12～16 g，由中山大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵) 2009-011。新生大鼠隨機分為4組:空白對照組(Air + NS組)、Cdk5抑制劑roscovitine對照組(Air + Ros組)、Sevo + NS組和Sevo + Ros組。前2組吸入空氣，后2組吸入2. 8%七氟醚4 h。Air + Ros組和Sevo + Ros組在麻醉前15 min經(jīng)腹腔注射10 mg/kg的Cdk5抑制劑roscovitine。Air + NS組和Sevo + NS組則在麻醉前15 min經(jīng)腹腔注射150 μL生理鹽水。麻醉結(jié)束后4h，每組各取5只幼鼠，取新鮮皮質(zhì)組織，Western blot檢測P35、P25、Cdk5，CRMP1、2、4蛋白表達以及CRMP2 Ser 522磷酸化水平。出生后30 d每組各取6只幼鼠，取腦進行高爾基染色，制備冰凍切片，鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)。其余幼鼠在出生后25～27 d進行曠場試驗，31～32 d進行情景依賴性恐懼記憶檢測。

2方法

2.1七氟醚吸入麻醉模型的建立參照我們以前的方法［9］，將需要吸入七氟醚的P7新生大鼠置于自制透明麻醉箱內(nèi)，該麻醉箱與麻醉呼吸機回路連接，七氟醚以純氧作為載氣，經(jīng)麻醉揮發(fā)罐進入麻醉箱，麻醉箱出口處接氣體監(jiān)護儀監(jiān)測麻醉氣體濃度、氧濃度和二氧化碳濃度。調(diào)整揮發(fā)罐刻度和氧氣流量，維持七氟醚濃度處于2. 8%。對照組動物置入另一個麻醉箱中吸入空氣，吸入時間均為4 h。麻醉箱置于水浴箱中，溫度維持36～37℃。麻醉過程中大鼠保持自主呼吸，持續(xù)觀察大鼠的呼吸頻率和膚色。2.2 Western blot檢測蛋白的表達參照我們以前的方法［9］，麻醉結(jié)束后4 h，斷頭處死幼鼠，冰上快速分離皮質(zhì)，加入適量裂解液勻漿后提取蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度并調(diào)平各組蛋白濃度。各樣本等量蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入如下Ⅰ抗:β-actin (1∶1 000 ) ; P35/P25 (1∶500) ; Cdk5、p-CRMP2 Ser522、CRMP1、CRMP2、CRMP4(1∶1 000)。4℃孵育過夜，1∶1 000Ⅱ抗室溫孵育2 h，使用ECL發(fā)光液進行膠片顯影。膠片掃描后用Image J軟件測量蛋白條帶的灰度值。其中p-CRMP2 Ser522/CRMP2比值行半定量分析。

2.3高爾基染色根據(jù)FD Rapid GolgiStainTM試劑盒說明書進行染色，大致步驟如下:完整腦組織取出后用雙蒸水洗去表面血液，濾紙吸干，放入AB混合液中避光浸泡約20 d，然后轉(zhuǎn)移至C液中繼續(xù)避光浸泡3～4 d。取出腦組織固定到冰凍切片機中進行冠狀位切片，厚度設(shè)定為150 μm。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，為得到包含前額葉皮層的切片，切片范圍從對耳線14. 20 mm至13. 20 mm。切片固定在經(jīng)明膠處理的載玻片上，陰干24 h，然后浸泡于DE混合液中10 min進行脫色，經(jīng)過后續(xù)漂洗、脫水、透明化處理后，用樹膠封片，－20℃避光保存，待鏡下觀察。2.4神經(jīng)元樹突形態(tài)學(xué)分析高爾基染色后的皮層第V層神經(jīng)元表現(xiàn)為以下特征: (1)神經(jīng)元胞體為錐形; (2)神經(jīng)元胞體處于第V層; (3)頂端樹突指向皮層表面并與第1層神經(jīng)元發(fā)生廣泛聯(lián)系; (4)底端樹突呈根系樣分布。每個鼠腦左右兩側(cè)各選擇5個合適的神經(jīng)元進行分析，選擇標準為: (1)神經(jīng)元胞體處于切片的中央; (2)神經(jīng)元的樹突和軸突充分被染色; (3)神經(jīng)元胞體處至少發(fā)出3個樹突，每個樹突至少再分支1次。使用Leica DM6000顯微鏡在200倍下對選定的神經(jīng)元進行Z軸掃描，然后使用Imaris軟件進行神經(jīng)元重建，神經(jīng)元的胞體和突起都能被軟件追蹤，并繪畫出完整的模擬圖像，根據(jù)得出的模擬圖像測量以下指標: (1)各級樹突分支長度; (2)樹突總長度; (3)希恩分析(Sholl Analysis) :以神經(jīng)元胞體為中心繪制同心圓，每個圓環(huán)之間間距20 μm，統(tǒng)計同心圓與樹突產(chǎn)生的交點數(shù)量，以此估計樹突分支情況，空間分布和長度。每個腦片隨機選取6個神經(jīng)元拍照分析，取其平均值作為該動物的值。

2.5大腦認知功能檢測大腦認知功能檢測方法包括: (1)曠場實驗:曠場由四周為透明玻璃，黑色底面的箱子構(gòu)成，將大鼠從箱子的中心放入，任其自由運動10 min。實驗進行3 d，在每天同一時點檢測?？臻g攝像裝置記錄大鼠所有的運動過程。分析軟件通過分析大鼠在箱子中總的平均運動距離和速度，以及穿越中心區(qū)的平均次數(shù)和在中心區(qū)停留的時間，評估大鼠是否有運動功能障礙以及焦慮抑郁。(2)情景依賴性恐懼記憶檢測:在暗箱內(nèi)放置一個帶有揚聲器的電擊箱，將31日齡的大鼠放入恐懼電擊箱中，適應(yīng)2 min，并對大鼠進行連續(xù)5次的聲音條件刺激(2 000 Hz，90 dB，30 s)與聲音提示的非條件刺激(足底電刺激1 mA，2 s)相結(jié)合的訓(xùn)練，配對呈現(xiàn)5次以建立恐懼記憶模型。在24 h后將大鼠放回電擊箱8 min，檢測大鼠的“木僵時間”，通過計算木僵時間占實驗總時間的百分比評估其場景恐懼記憶的能力。

3統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad 6統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。Western blot、曠場實驗、恐懼記憶檢測的組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)。各級樹突長度的組間比較采用重復(fù)測量的多因素方差分析(two-way ANOVA with repea-ted measures)，七氟醚暴露及樹突分支層級分別視為兩個獨立因素。希恩分析的組間比較采用重復(fù)測量的多因素方差分析，七氟醚暴露及圓環(huán)直徑分別視為兩個獨立因素。所有組間兩兩比較均采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1七氟醚對新生大鼠生理的影響

在麻醉處理過程中，幼鼠呼吸均勻，膚色紅潤，無明顯呼吸抑制。麻醉后幼鼠均正常生長，所有實驗動物均存活，沒有出現(xiàn)意外死亡。

2新生大鼠皮質(zhì)P35、P25和Cdk5表達的變化

各組Cdk5表達整體比較差異不顯著。Air + NS組與Air + Ros組比較，P35和P25的蛋白水平差異均不顯著，提示單獨使用Cdk5抑制劑roscovitine并不會影響兩者的水平。與Air + NS組比較，Sevo + NS組的P35減少了47. 32% (P＜0. 05)，同時P25增加了173. 77% (P＜0. 05)，提示七氟醚暴露激活了新生大鼠PFC中的Cdk5通路。Sevo + Ros組的P35比Sevo + NS組增加了78. 81% (P＜0. 05)，其P25比Sevo + NS組減少了60. 22%(P＜0. 05)，提示roscovitine抑制了七氟醚誘導(dǎo)的Cdk5激活，見圖1。

Figure 1.The expression of P35，P25 and Cdk5 in the prefrontal cortex of neonatal rats.Mean±SEM.n =4.*P＜0. 05 vs Air + NS;#P＜0.05 vs Sevo + NS.圖1　新生大鼠前額葉皮層P35、P25和Cdk5表達的變化

3新生大鼠皮質(zhì)CRMP1、2、4蛋白以及磷酸化CRMP2 Ser522蛋白水平的變化

Air + NS組與Air + Ros組比較，總CRMP1、CRMP2、CRMP4以及p-CRMP2 Ser522/CRMP2差異均不顯著，提示單獨使用Cdk5抑制劑roscovitine并不會影響以上蛋白的水平。與Air + NS組比較，Sevo + NS組的總CRMP1、2和4表達分別下降了36. 22%、53. 74%和51. 28%，同時p-CRMP2 Ser522/ CRMP2比值增加了96. 20%，提示七氟醚暴露導(dǎo)致新生大鼠PFC中CRMP1、2和4的表達下調(diào)，并促進CRMP2的Ser522位點磷酸化。Sevo + Ros組的總CRMP1、4和Sevo + NS組比較分別增加了56. 95% 和88. 91%，而p-CRMP2 Ser522/CRMP2比值則下降了43. 58%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示roscovitine一定程度逆轉(zhuǎn)了七氟醚暴露導(dǎo)致的部分CRMP蛋白表達和磷酸化改變，見圖2。

4新生大鼠前額葉皮層第V層錐體神經(jīng)元樹突形態(tài)發(fā)育的變化

高爾基染色后對神經(jīng)元進行鏡下觀察和軟件重建，并進行形態(tài)學(xué)分析，分析指標包括樹突總長度，各級樹突長度，以及希恩分析。

Air + NS組與Air + Ros組比較，樹突總長度差異不顯著。與Air + NS組比較，Sevo + NS組的樹突總長度下降了22. 80%(P＜0. 01)。Sevo + Ros組的樹突總長度比Sevo + NS組增加了30. 02% (P＜0. 01)，提示七氟醚導(dǎo)致發(fā)育中的皮層神經(jīng)元樹突生長受阻，而roscovitine部分逆轉(zhuǎn)了七氟醚的作用。

比較第二級樹突長度，Air + NS組與Air + Ros組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與Air + NS組比較，Sevo + NS組的第二級樹突長度減少了30. 87%。Sevo + Ros組的第二級樹突長度比Sevo + NS組增加了30. 23%。其余各級樹突長度的組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示七氟醚毒性主要是影響皮層神經(jīng)元第二級樹突的發(fā)育。

分別比較60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點數(shù)，Air + NS組與Air + Ros組相比較差異不顯著。與Air + NS組比較，Sevo + NS組在60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點數(shù)分別減少了22. 47%和44. 44%。Sevo + Ros組在60和80 μm直徑圓環(huán)上的交點數(shù)比Sevo + NS組分別增加了33. 33%和55%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。其余各直徑圓環(huán)上的交點數(shù)的組間比較差異不顯著。提示七氟醚還通過影響樹突發(fā)出分支和分支的空間延伸而影響神經(jīng)元發(fā)育，見圖3。

5新生大鼠大腦認知功能的改變

曠場實驗發(fā)現(xiàn)各組的運動總距離和平均速度整體比較差異不顯著，提示七氟醚和Cdk5抑制劑均沒有導(dǎo)致大鼠的運動能力障礙和情感抑郁或焦慮。

Figure 2.The protein levels of CRMP1，2，4 and p-CRMP2 Ser522 in the prefrontal cortex of neonatal rats.Mean±SEM.n = 5.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01vs Air + NS;#P＜0. 05 vs Sevo + NS.圖2　Roscovitine對新生大鼠前額葉皮層總CRMP1、2、4蛋白以及p-CRMP2 Ser522磷酸化蛋白水平的影響

情景依賴性恐懼記憶檢測發(fā)現(xiàn)24 h后“木僵”時間整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Sevo + NS組大鼠的“木僵”時間比Air + NS組減少約21% (P＜0. 01)，提示七氟醚損害了與海馬相關(guān)的恐懼記憶的維持(長時記憶) ;而Sevo + Ros組與Sevo + NS組比較“木僵”時間增加了82% (P＜0. 05)，提示抑制Cdk5通路可以減輕七氟醚引起的認知功能障礙，見圖4。

討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)七氟醚激活了新生大鼠皮質(zhì)Cdk5通路，提高了CRMP2 Ser522位點的磷酸化水平，降低了CRMP1、CRMP2與CRMP4總蛋白表達，抑制了幼鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元樹突的生長和分支，并損害了幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Cdk5抑制劑逆轉(zhuǎn)了七氟醚誘導(dǎo)的上述部分蛋白變化、樹突發(fā)育障礙和認知功能損害，提示Cdk5-CRMP通路在七氟醚抑制新生大鼠樹突發(fā)育中起著重要作用。

Figure 3.Developmental morphology analysis of layer V pyramidal neurons in the prefrontal cortex of neonatal rats.A～D: the images captured under microscope (×200) ; E～H: the simulated images of pyramidal neurons reconstructed by Imaris; I～K: the quantitative analysis of total dendrite length，dendritic length at each level and Sholl analysis.Mean±SEM.n =6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs Air + NS;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs Sevo + NS.圖3　Roscovitine對新生大鼠前額葉皮層第V層錐體神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的影響

Figure 4.Detection of cognitive impairment in neonatal rats.The results were compared by two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test.Mean±SEM.n =11.＊＊P＜0. 01 vs Air + NS;#P＜0. 05 vs Sevo + NS.圖4　Roscovitine對新生大鼠大腦認知功能發(fā)育的影響

前額葉皮質(zhì)作為大腦重要的組成部分，在抽象思維、適應(yīng)行為、策略決定、行為選擇等大腦高級功能方面起著重要作用［10-11］。因此，本研究選擇前額葉皮質(zhì)作為研究的對象。突觸形成是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它使各個孤立神經(jīng)元得以聯(lián)結(jié)成相互溝通的網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)元樹突的生長、延展、空間分布，乃至樹突棘的數(shù)量和分布密度，均與突觸形成的數(shù)量與質(zhì)量密切相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)與空氣對照組比較，新生大鼠接受七氟醚暴露后，樹突的總長度、第二級樹突分支長度以及希恩分析中60和80 μm直徑圓環(huán)交點數(shù)均出現(xiàn)顯著下降，說明樹突以及次級分支的生長、延展受阻，提示七氟醚暴露干擾新生大鼠前額葉皮層神經(jīng)元樹突的正常生長發(fā)育，影響突觸形成，進而阻礙成熟神經(jīng)回路的形成。此外，本實驗在新生大鼠七氟醚暴露后30 d，進行行為學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)大鼠的木僵時間下降，提示七氟醚損害幼鼠記憶能力。由于神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的正確形成是大腦具備高級功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此七氟醚對樹突生長發(fā)育的干擾可能是其導(dǎo)致認知功能損害的重要原因之一。Briner等［12］研究發(fā)現(xiàn)出生后5 d和10 d的Wistar大鼠經(jīng)丙泊酚麻醉后，前葉皮質(zhì)第V層椎體神經(jīng)元的樹突棘密度顯著下降，與我們的結(jié)果一致。

CRMP蛋白家族，包括CRMP1～5共5個成員，在發(fā)育階段的神經(jīng)組織中豐富表達。CRMP1沿著細胞內(nèi)微管進行分布，參與突起生長、細胞變形和遷移過程［13］。CRMP4則與微絲結(jié)合促進微絲的聚集，有促進突起形成和生長的作用［14］。CRMP2主要通過與微管蛋白二聚體結(jié)合，參與神經(jīng)元極化和軸突生長過程［15］。磷酸化的CRMP2導(dǎo)致與微管蛋白二聚體的結(jié)合能力下降［16］，抑制軸突生長，而且也參與了樹突發(fā)育的調(diào)節(jié)。CRMP2 Ser522位點磷酸化可通過Cdk5激活調(diào)節(jié)，而Cdk5的活性受到細胞周期素樣蛋白P25的調(diào)控。在正常情況下，P35在神經(jīng)細胞中特異性表達，而在某些傷害性刺激的作用下，P35 被calpain剪切，P25是calpain剪切殘留下來的羧基端部分，P25可與Cdk5結(jié)合并激活Cdk5。本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚雖然沒有影響新生大鼠皮質(zhì)Cdk5蛋白的表達量，但顯著減少了P35的表達，增加了P25的表達，提示七氟醚激活了Cdk5的活性。這一點也可以從七氟醚增加了Cdk5下游CRMP2 Ser522蛋白磷酸化得到證實。此外，七氟醚減少了CRMP1、2、4總蛋白的表達，提示七氟醚從基因水平調(diào)節(jié)了CRMP蛋白表達。Cdk5抑制劑roscovitine預(yù)處理不僅通過減輕七氟醚導(dǎo)致的P25表達增加和CRMP2 Ser522蛋白磷酸化，有效地抑制了Cdk5過度激活，也逆轉(zhuǎn)了七氟醚對CRMP1、4總蛋白的抑制，而且逆轉(zhuǎn)了七氟醚對樹突發(fā)育的抑制以及對大腦認知功能的損害，提示Cdk5-CRMP通路激活是七氟醚引起新生大鼠皮質(zhì)樹突發(fā)育障礙和認知功能損害的機制之一。

Cdk5功能復(fù)雜，在神經(jīng)細胞的分化、遷移和凋亡方面起著重要作用［17-19］。在Sema3A誘發(fā)的生長錐塌陷經(jīng)典途徑中，Sema3A與其受體結(jié)合激活Rac1，進而激活細胞內(nèi)下游信號通路Cdk5，Cdk5繼而磷酸化CRMP2 Ser522位點［20］。磷酸化的CRMP2降低了與微管蛋白異二聚體的結(jié)合能力，最終導(dǎo)致微管的解聚，軸突回縮［16］。Wang等［7］研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠預(yù)先給予Cdk5抑制劑，能顯著減少異氟醚暴露引起的海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，提示Cdk5的過度激活與吸入麻醉藥的神經(jīng)毒性有關(guān)，這與本研究的結(jié)果一致。CRMP磷酸化除了受Cdk5調(diào)節(jié)，還與GSK-3β通路關(guān)系密切，GSK-3β激活使CRMP2 Thr518、Thr509和Thr514位點磷酸化［20］。Cdk5與GSK-3β通路之間相互影響，一方面，但GSK-3β磷酸化作用依賴于Cdk5對CRMP2 Ser522位點的磷酸化［21］;另一方面GSK-3β能與P25結(jié)合并增強其活性，因此推測P25激活Cdk5可能是通過增強GSK-3β活性介導(dǎo)的［22］。Cdk5除了調(diào)節(jié)下游的CRMP磷酸化狀態(tài)，還能磷酸化多種微管調(diào)節(jié)蛋白［23］，如雙腎上腺皮質(zhì)激素的絲氨酸297位點以及核遷移蛋白，參與調(diào)節(jié)微管的聚合和神經(jīng)元的細胞核遷移［24］。因此，Cdk5-CRMP通路可能并不是七氟醚引起前額葉皮層神經(jīng)發(fā)育毒性的唯一機制，Cdk5是否還會作用于其它下游靶點，以及與GSK-3β通路的關(guān)系，都有待進一步研究。

本實驗存在一定的局限性，首先神經(jīng)元形態(tài)學(xué)分析中只觀察了樹突的形態(tài)，沒有進一步檢測神經(jīng)元的樹突棘密度;其次，沒有檢測CRMP的其它上游通路如GSK-3β、RoA的作用;這些都將在后續(xù)的實驗研究中完善。

綜上所述，本研究通過給出生后7 d新生大鼠吸入2. 8%七氟醚4 h，并聯(lián)合使用Cdk5抑制劑，發(fā)現(xiàn)七氟醚通過激活Cdk5-CRMP通路干擾了新生大鼠前額葉皮層神經(jīng)元樹突的正常發(fā)育和幼鼠認知功能。

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(責(zé)任編輯:林白霜，余小慧)

Role of Cdk5-CRMP pathway in sevoflurane-induced dendritic developmental disorder of neurons in prefrontal cortex of neonatal rats

LIU Yan-hui1，XIA Shu-xuan1，LIU Ya-fang1，LIU Chui-liang2，LI Yu-juan1
(1Department of Anesthesiology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;2Department of Anesthesiology，Chancheng Central Hospital，F(xiàn)oshan 528030，China.E-mail: yujuan_04@aliyun.com)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.10.001

1000-4718(2015)10-1729-08

2015-07-03

2015-09-11

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.S2013010016207) ;廣東省科技社會發(fā)展項目(No.2014A020212147) ;廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(No.A2013207)

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