姜學(xué)革，常 德，黃佩佳，劉 巖，蘇龍翔，朱遠(yuǎn)方，劉長庭

1解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853；2武警總醫(yī)院 呼吸科，北京 100039；3深圳華大基因研究院，廣東深圳 518083

基礎(chǔ)研究論著

空間環(huán)境誘導(dǎo)屎腸球菌株的轉(zhuǎn)錄組序列測定與分析

姜學(xué)革1，常 德2，黃佩佳1，劉 巖1，蘇龍翔1，朱遠(yuǎn)方3，劉長庭1

1解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853；2武警總醫(yī)院 呼吸科，北京 100039；3深圳華大基因研究院，廣東深圳 518083

目的對屎腸球菌進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序，對比空間環(huán)境作用后菌株的基因表達(dá)差異。方法提取菌株總RNA并進(jìn)行測序文庫構(gòu)建，利用第二代高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序，對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、組裝、注釋和分析，并通過比對地面對照菌株的轉(zhuǎn)錄組分析空間飛行后屎腸球菌株的基因表達(dá)差異。結(jié)果空間環(huán)境作用于屎腸球菌后，大量基因表達(dá)出現(xiàn)差異，包括1 036個基因表達(dá)下調(diào)，123個基因表達(dá)上調(diào)，基因本體功能和京都基因與基因組信號通路注釋表明差異表達(dá)基因主要分布于生長和代謝相關(guān)通路。結(jié)論屎腸球菌全轉(zhuǎn)錄組測序和分析明確，空間飛行后的屎腸球菌生長和代謝相關(guān)基因表達(dá)改變。

空間環(huán)境；屎腸球菌；轉(zhuǎn)錄組；測序

屎腸球菌屬于革蘭陽性腸球菌群，是人和動物腸道的定植菌群，可生長在各種植物、動物、昆蟲體內(nèi)，也可在其他環(huán)境中生長[1-2]。腸球菌屬以往被認(rèn)為能抑制哺乳動物胃腸道內(nèi)其他細(xì)菌的生長，是一種無害的共生菌，故常作為益生菌加入到食品中[3-4]。后續(xù)的研究表明，某些腸球菌屬于條件致病菌，可引起人體多系統(tǒng)感染[5]。隨著中國載人航天事業(yè)的發(fā)展和空間站的建立，我國對外太空的探索活動越來越多。一些條件性致病菌，包括屎腸球菌通過宇航員帶入太空。因此，開展空間環(huán)境對屎腸球菌的影響研究是一項迫切的任務(wù)。我們將搭載中國神舟八號飛船的屎腸球菌，太空飛行17 d后，分離獲得空間環(huán)境誘導(dǎo)的屎腸球菌菌株，并對該菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組序列測序和分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下[6-9]。

材料和方法

1 材料 屎腸球菌(LCT-EFS)來自搭載中國神舟八號飛船太空飛行17 d后分離的菌株，地面對照菌株LCT-EFG來自中國菌種保存中心，高通量測序儀Illumina HiSeq 2000(Illumina公司)，總RNA提取試劑盒購自天根公司。

2 屎腸球菌培養(yǎng)及RNA提取 將搭載神舟八號飛船的屎腸球菌分離株接種至100 ml LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24 h。收取菌體，按3 mg/ml的濃度加入100 μl含溶菌酶的TE緩沖液重懸，室溫孵育10 min，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書，進(jìn)行裂解蛋白、取出DNA步驟，最后得到細(xì)菌的總RNA。

3 文庫構(gòu)建和測序 將rRNA去除后，加入破碎緩沖液將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymeraseⅠ合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加PolyA并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測序。

4 測序數(shù)據(jù)的過濾處理 測序結(jié)束后得到的最小讀取單位(Reads)，并不都是有效的，里面含有帶接頭的、重復(fù)的、測序質(zhì)量很低的Reads，會影響后續(xù)分析。通過去除含接頭的Reads、實際未測出堿基(N)的比例＞5%的Reads、低質(zhì)量Reads(質(zhì)量值Q≤5的堿基數(shù)占整個Read的50%以上)，最終獲得純凈Reads (clean reads)。

5 測序數(shù)據(jù)的評估 通過短Reads比對軟件SOAPaligner/Soap2，將Clean reads分別比對到參考基因組和參考基因序列，從而獲得對項目總體情況的認(rèn)識[10]。將過濾得到的Reads與參考rRNA序列比對，比對上的Reads認(rèn)為是rRNA序列。在轉(zhuǎn)錄組實驗過程中，通過物理或化學(xué)方法將轉(zhuǎn)錄本打斷成短片段并上機測序。如果打斷隨機性差，Reads偏向于來自基因特定區(qū)域，將會直接影響轉(zhuǎn)錄組的各項分析結(jié)果。把Reads在基因上的位置標(biāo)準(zhǔn)化到相對位置(Reads在基因上的位置與基因長度的比值)，統(tǒng)計基因的不同位置比對上的Reads數(shù)。如果打斷隨機性好，Reads在基因各部位應(yīng)分布得比較均勻。

6 基因表達(dá)注釋 基因覆蓋度指每個基因被Reads覆蓋的百分比，其值等于基因中Unique mapping reads覆蓋的堿基數(shù)跟基因編碼區(qū)所有堿基數(shù)的比值。使用每百萬比對到參考序列/參考基因組上的reads中來自于某基因每千堿基長度的Reads數(shù)(reads per kb per million reads，RPKM)，設(shè)RPKM (A)為基因A的表達(dá)量，則C為唯一比對到基因A的Reads數(shù)，N為唯一比對到參考基因的總Reads數(shù)，L為基因A編碼區(qū)的堿基數(shù)[11]。RPKM法能消除基因長度和測序量差異對基因表達(dá)的影響，計算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異。

7 基因差異表達(dá)分析 通過錯誤發(fā)生率(false discovery rate，F(xiàn)DR)多重檢驗校正P值。根據(jù)基因的表達(dá)量(RPKM值)計算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。FDR值越小，差異倍數(shù)越大，表明表達(dá)差異越顯著。本研究中將差異表達(dá)基因定義為FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)錄組RNA提取 總RNA較為完整，OD260比OD280為2.1，OD260同OD230比值等于1.91，基本符合轉(zhuǎn)錄組測序過程中文庫構(gòu)建的需求。見圖1。

2 全轉(zhuǎn)錄組測序序列評估 以地面屎腸球菌LCTEFG基因組為參考，實驗中所測菌株的轉(zhuǎn)錄組中，能夠比對到參考序列上的總Reads所占比例達(dá)到97.92%，其中沒有錯配87.09%。rRNA的Reads比例達(dá)到1.5%，在后續(xù)的分析中將去除這部分rRNA。圖2為該株屎腸球菌的測序隨機評價，橫坐標(biāo)是基因的相對位置，縱坐標(biāo)是能夠比對到對應(yīng)位置Reads的數(shù)目，從圖中可看出Reads在基因各部位分布比較均勻，表明該菌株測序中打斷隨機性較好。

3 基因注釋與差異表達(dá)分析 1 760個基因，約68%的基因覆蓋度達(dá)到90% ～ 100%，匹配符合度達(dá)到50%以上的基因占91%(圖3)。通過RPKM法計算基因表達(dá)量，得到1 036個基因表達(dá)下調(diào)，123個基因表達(dá)上調(diào)?；虮倔w功能分類顯示差異基因主要同ncRNA和tRNA代謝相關(guān)，基因組信號通路注釋主要集中在核糖體、萜類骨架的生物合成、硫中繼系統(tǒng)、菌類細(xì)胞周期、氨酰-tRNA生物合成、肽聚糖生物合成、谷氨酸代謝和嘌呤代謝等通路。表明經(jīng)過空間環(huán)境作用后，屎腸球菌的生長和代謝受到影響。

討 論

屎腸球菌是存在于人體內(nèi)的條件性致病菌，可隨航天員進(jìn)入太空，受到空間環(huán)境因素，如失重、輻射和磁場等的影響。有研究表明，某些微生物暴露于空間環(huán)境后，其毒力和耐藥性等方面發(fā)生改變[9,12]。因此，開展空間環(huán)境對屎腸球菌的影響和作用機制研究非常必要。

本研究利用第二代Illumina HiSeq 2000測序技術(shù)對屎腸球菌菌株的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序、注釋和差異分析，發(fā)現(xiàn)1 036個基因表達(dá)下調(diào)，123個基因表達(dá)上調(diào)，說明經(jīng)過太空飛行后屎腸球菌的大部分基因表達(dá)受抑，且這些差異基因主要集中在屎腸球菌的代謝通路。太空飛行后屎腸球菌的表型變化需進(jìn)一步研究，特別是該菌株致病性的研究尤為重要，對空間生物安全性評估具有重要意義。本課題對空間環(huán)境下屎腸球菌的變化和規(guī)律研究尚屬于初步研究，但是這些轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)為后續(xù)研究以及地面屎腸球菌的變化規(guī)律研究奠定了基礎(chǔ)。

圖 1 屎腸球菌菌株總RNA電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of LCT-EFS total RNA

圖 2 屎腸球菌測序隨機性評價Fig. 2 Random assessment of LCT-EFS

圖 3 屎腸球菌的基因覆蓋度Fig. 3 Distribution of genes' coverage of LCT-EFS

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Transcriptome sequencing and analysis of space environment induced Enterococcus Faecium strain

JIANG Xuege1, CHANG De2, HUANG Peijia1, LIU Yan1, SU Longxiang1, ZHU Yuanfang3, LIU Changting11Department of Respiratory Diseases in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Respiratory Medicine, General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces, Beijing 100039, China;3BGI-Shenzhen, Shenzhen 518083, Guangdong Province, China

LIU Changting. Email: liuchangt@gmail.com

Objective To compare the differences of gene expression of Enterococcus faecium exposed to space environment through whole transcriptome sequencing. Methods The total RNA of Enterococcus faecium was extracted and library was constructed followed by sequencing on HiSeq 2000. Then the raw datum of transcriptome was obtained, fi ltered, assembled and annotated. The difference of gene expression was analyzed by comparing the transcriptome of Enterococcus faecium after spacef l ight with one on the ground. Results After spacef l ight, amounts of genes expressed differently, including 1 036 down-regulated genes and 123 upregulated genes. The annotation of GO function and KEGG pathway revealed genes with different expression were mainly associated with bacteria growth and metabolism. Conclusion The whole transcriptome of Enterococcus faecium strain is sequenced and annotated clearly, which suggests that after spacef l ight the expression of genes relating with growth and metabolism has changed.

space environment; enterococcus faecium; transcriptiome; sequencing

R 85

A

2095-5227(2015)02-0148-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.015

時間：2014-08-20 09:15

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140820.0915.001.html

2014-06-16

國家“973”重點基礎(chǔ)研究計劃(2014CB744400)；武器預(yù)研重點基金(9140A26040312JB10078)；載人航天領(lǐng)域項目(040203)；國家自然科學(xué)基金項目(81350020)

Supported by National “973” Program for Basic Research of China(2014 CB744400); National Natural Science Foundation of China(81350020)

姜學(xué)革，女，副主任技師。Email: jiangxuege1966@126. com

劉長庭，男，教授，主任醫(yī)師， 博士生導(dǎo)師。Email: liu changt@gmail.com