李艷榮，郭蓮怡

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001

潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血T細(xì)胞表面CD4+CD45+分子表達(dá)的變化及臨床意義

李艷榮，郭蓮怡

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121001

目的探討潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)患者外周血T細(xì)胞表面CD4+CD45+分子的表達(dá)及臨床價(jià)值。方法選取2012年3月- 2013年12月于我院消化科住院治療的UC患者80例，其中輕度活動(dòng)期27例，中度活動(dòng)期28例，重度活動(dòng)期25例，健康對照組80例，用流式細(xì)胞儀分別檢測各期患者及對照組外周血T細(xì)胞表面CD4+CD45+分子的百分含量，并進(jìn)行比較以判斷病情輕重。結(jié)果外周血CD4+CD45+T細(xì)胞表達(dá)含量，UC組為52.93%±3.64%，對照組為41.34%±2.94%，UC組高于對照組(t=-22.159，P＜0.05)；輕度活動(dòng)期為50.99%±1.45%，中度活動(dòng)期為52.66%±1.41%，重度活動(dòng)期為55.18%±2.18%，中度活動(dòng)期高于輕度活動(dòng)期，重度活動(dòng)期高于中度活動(dòng)期，各組間比較，F(xiàn)=39.850(P＜0.05)。結(jié)論外周血CD4+CD45+T細(xì)胞表達(dá)含量，UC組高于對照組，且隨著病情加重而明顯增高，對臨床診斷及判斷病情有指導(dǎo)意義。

潰瘍性結(jié)腸炎；CD4+CD45+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；流式細(xì)胞儀；免疫調(diào)節(jié)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種常見腸道炎癥性疾病，病變主要累及黏膜和黏膜下層，多位于遠(yuǎn)端直腸和結(jié)腸，但可向近側(cè)延伸，甚至遍布整個(gè)結(jié)腸，臨床上表現(xiàn)為慢性病程，癥狀為腹瀉或便秘，排黏液膿血便，里急后重，伴或不伴腹痛，反復(fù)發(fā)作。該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分明確[1]。目前認(rèn)為，其發(fā)病是環(huán)境、遺傳、感染、免疫、精神、腸道菌群及過敏等多種因素共同作用的結(jié)果，免疫失調(diào)是其發(fā)病的關(guān)鍵因素[2]。近年來發(fā)現(xiàn)，CD4+CD45+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)在UC患者發(fā)病中起著重要作用[3]。本文研究80例UC患者外周血T細(xì)胞表面CD4+CD45+分子的表達(dá)，其范圍為52.93%±3.64%，明顯高于80例健康對照者的范圍(41.34%±2.94%)，為臨床診斷提供了依據(jù)。

對象和方法

1 研究對象 隨機(jī)選取2012年3月- 2013年12月于我院消化科住院治療的活動(dòng)期UC患者80例，其中男44例，女36例，年齡32 ～ 66(49±3)歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組于廣州達(dá)成的我國炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年)[4]，按照SutherlandDAI[5]分期，其中輕度活動(dòng)期27例，中度活動(dòng)期28例，重度活動(dòng)期25例。健康對照組為正常的健康志愿者80例，其中男41例，女39例，年齡27 ～ 61(47±4)歲，無自身免疫性疾病病史，無家族遺傳性疾病史，入選時(shí)無腹瀉。兩組年齡、性別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 儀器與試劑 人Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自上海新睿生物科技有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗人CD4、PE標(biāo)記的抗人CD45抗體均購自上海裕平生物科技有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液購自GibcoBRL公司，流式細(xì)胞儀FACScantoⅡ購自美國Becton-Dickinson(BD)公司。

3 方法 收集對照組受試者和UC組患者清晨空腹條件下靜脈血各5 ml，采血管中加入肝素抗凝。血標(biāo)本采集6 h內(nèi)應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法，以1 500 r/min的速度離心分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuelear cell，PBMC)，經(jīng)200目濾布濾過，制成單細(xì)胞懸液。用RPMI 1640完全培養(yǎng)基-2洗滌2次，將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×105/ml，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的CD4抗體和PE標(biāo)記的CD45抗體，常溫孵育30 min，加入PBS液洗滌2次，速度為2 000 r/min，離心5 min后棄去上清液，準(zhǔn)備上機(jī)。應(yīng)用FACScantoⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，用同型對照做陰性對照消除自發(fā)熒光，用空白對照消除非特異熒光，設(shè)門劃出擬定的淋巴細(xì)胞群，根據(jù)設(shè)定的CD4與CD45單抗分析結(jié)合其陽性細(xì)胞數(shù)及百分比，在雙參數(shù)圖上得到CD4+CD45+細(xì)胞的百分比。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用-x±s表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 外周血CD4+CD45+T細(xì)胞表達(dá)含量，UC組為52.93%±3.64%，對照組為41.34%±2.94%，UC組高于對照組(t=-22.159，P＜0.05)，為臨床診斷提供了依據(jù)。見圖1。

2 UC各活動(dòng)期外周血CD4+CD45+T細(xì)胞表達(dá)含量UC組輕度活動(dòng)期27例，中度活動(dòng)期28例，重度活動(dòng)期25例，輕度活動(dòng)期為50.99%±1.45%，中度活動(dòng)期為52.66%±1.41%，重度活動(dòng)期為55.18%±2.18%，中度活動(dòng)期高于輕度活動(dòng)期，重度活動(dòng)期高于中度活動(dòng)期，各組間比較，F(xiàn)=39.850(P＜0.05)，隨著病情加重，外周血CD4+CD45+T細(xì)胞表達(dá)含量明顯升高，對判斷病情有指導(dǎo)意義。見圖2。

圖 1 對照組與UC組外周血CD4+CD45+T細(xì)胞表達(dá)含量比較(aP＜0.05, vs controls)Fig. 1 Comparison of peripheral blood CD4+CD45+T cells expression content between the control group and the UC group (aP＜0.05, vs controls)

圖 2 疾病各活動(dòng)期患者外周血CD4+CD45+T細(xì)胞表達(dá)含量比較(aP＜0.05，bP＜0.05，cP＜0.01, vs其他組)Fig. 2 Comparison of peripheral blood CD4+CD45+T cells expression content between different activity periods of diseaseaP＜0.05，bP＜0.05，cP＜0.01, vs other activity periods

討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種常見的直腸和結(jié)腸慢性炎癥性疾病，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，腸道黏膜免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)是其發(fā)病的重要因素，腸黏膜免疫系統(tǒng)失衡可導(dǎo)致免疫防御的破壞[6]。細(xì)菌或非細(xì)菌的抗原誘導(dǎo)激活腸道黏膜免疫細(xì)胞，并分化、成熟后移行到腸黏膜上皮細(xì)胞和固有層，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抵御有害物質(zhì)的入侵[7-8]。腸黏膜組織內(nèi)淋巴細(xì)胞的異常激活，即為適應(yīng)性免疫，適應(yīng)性免疫由許多因素參與完成，其中T細(xì)胞是非常重要的免疫活性細(xì)胞[9]。

CD4+CD45+T細(xì)胞屬于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，CD4+在抗原識別受體中能起到輔助作用，CD45+在多種細(xì)胞表面均有表達(dá)，比如血細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，其主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，影響造血干細(xì)胞分化和腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)移[10]。CD4+CD45+T細(xì)胞主要輔助于B細(xì)胞，其升高可導(dǎo)致B細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)CD8介導(dǎo)的反應(yīng)，出現(xiàn)免疫異常而致病[11-14]。

在UC患者中，患者的腸黏膜免疫系統(tǒng)受到有害物質(zhì)的入侵，破壞免疫平衡，腸黏膜的第一道防線相關(guān)淋巴組織就會(huì)被激活，即產(chǎn)生免疫應(yīng)答[15]。T細(xì)胞必然會(huì)參與免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡[16]。T細(xì)胞表面分子CD4+CD45+在抗原誘導(dǎo)刺激下，表達(dá)活躍，分泌的細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等會(huì)大量增加，加速免疫調(diào)節(jié)[13,17]。當(dāng)抗原效應(yīng)大于免疫調(diào)節(jié)功能時(shí)，即產(chǎn)生疾病[18]。

本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分別對80例UC患者及80例健康人進(jìn)行外周血T細(xì)胞CD4+CD45+表面分子檢測，結(jié)果顯示，UC組為52.93%±3.64%，對照組為41.34%±2.94%，比較其檢出范圍，UC組明顯高于對照組，故在UC患者中外周血T細(xì)胞CD4+CD45+表面分子表達(dá)會(huì)異常增高，導(dǎo)致免疫失衡，引起疾病發(fā)生，為臨床診斷UC提供依據(jù)。本研究中分別對UC組輕度活動(dòng)期27例、中度活動(dòng)期28例、重度活動(dòng)期25例進(jìn)行外周血T細(xì)胞CD4+CD45+表面分子檢測，結(jié)果輕度活動(dòng)期為50.99%±1.45%，中度活動(dòng)期為52.66%±1.41%，重度活動(dòng)期為55.18%±2.18%，隨著病情加重明顯升高，說明免疫失衡越重，疾病程度越嚴(yán)重，也就是說，UC患者外周血T細(xì)胞CD4+CD45+表面分子表達(dá)隨著疾病嚴(yán)重程度增加而升高，可用于臨床判斷病情輕重。

綜上所述，UC患者外周血T細(xì)胞CD4+CD45+表面分子含量高于正常人，即CD4+CD45+T細(xì)胞參與了免疫調(diào)節(jié)過程，且隨著病情加重而明顯增高，對臨床診斷及判斷病情輕重有一定指導(dǎo)意義。

1 Kamada N， Hisamatsu T， Okamoto S， et al. Unique CD14 intestinal macrophages contribute to the pathogenesis of Crohn disease via IL-23/IFN-gamma axis［J］. J Clin Invest， 2008， 118（6）： 2269-2280.

2 Lord JD， Valliant-Saunders K， Hahn H， et al. Paradoxically increased FOXP3+ T cells in IBD do not preferentially express the isoform of FOXP3 lacking exon 2［J］. Dig Dis Sci， 2012， 57（11）：2846-2855.

3 Furihata M， Sawada T， Okada T， et al. Total colectomy improves altered distribution of regulatory T cells in patients with ulcerative colitis［J］. World J Surg， 2006， 30（4）： 590-597.

4 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組. 我國炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012年·廣州）［J］. 內(nèi)科理論與實(shí)踐，2013， （1）： 61-75.

5 De Souza HS， West GA， Rebert N， et al. Increased levels of survivin， via association with heat shock protein 90， in mucosal T cells from patients with Crohn’s disease［J］. Gastroenterology，2012， 143（4）： 1017-26.e9.

6 Dahlén R， Strid H， Lundgren A， et al. Infliximab inhibits activation and effector functions of peripheral blood T cells in vitro from patients with clinically active ulcerative colitis［J］. Scand J Immunol， 2013，78（3）： 275-284.

7 毛靖偉，王英德．腸黏膜屏障在炎癥性腸病中作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2010，18（7）：695-698．

8 Liu L， Wang ZP， Xu CT， et al. Effects of rheum tanguticum polysaccharide on TNBS -induced colitis and CD4+T cells in rats［J］. World J Gastroenterol， 2003， 9（10）： 2284-2288.

9 Radulovic K， Rossini V， Manta C， et al. The early activation marker CD69 regulates the expression of chemokines and CD4 T cell accumulation in intestine［J］. PLoS One， 2013， 8（6）： e65413.

10 Liao CM， Zimmer MI， Shanmuganad S， et al. Dysregulation of CD1d-restricted type ii natural killer T cells leads to spontaneous development of colitis in mice［J］. Gastroenterology， 2012， 142（2）：326-34.e1.

11 Dias AM， Dourado J， Lago P， et al. Dysregulation of T cell receptor N-glycosylation： a molecular mechanism involved in ulcerative colitis［J］. Hum Mol Genet， 2014， 23（9）： 2416-2427.

12 Yamamoto-Furusho JK， álvarez-León E， Fragoso JM， et al. Protective role of interleukin-19 gene polymorphisms in patients with ulcerative colitis［J］. Hum Immunol， 2011， 72（11）：1029-1032.

13 Katsurada T， Kobayashi W， Tomaru U， et al. Decrease of peripheral and intestinal NKG2A-positive T cells in patients with ulcerative colitis［J］. PLoS One， 2012， 7（9）： e44113.

14 Lee JC， Lyons PA， Mckinney EF， et al. Gene expression profiling of CD8+ T cells predicts prognosis in patients with Crohn disease and ulcerative colitis［J］. J Clin Invest， 2011， 121（10）： 4170-4179.

15 Galitovskiy V， Qian J， Chernyavsky AI， et al. Cytokine-induced alterations of α7 nicotinic receptor in colonic CD4 T cells mediate dichotomous response to nicotine in murine models of Th1/Th17-versus Th2-mediated colitis［J］. J Immunol， 2011， 187（5）：2677-2687.

16 Chao K， Zhong BH， Zhang SH， et al. Imbalance of CD4（+） T cell subgroups in ulcerative colitis［J］. Zhonghua Yi Xue Za Zhi， 2011，91（23）： 1605-1608.

17 Bamias G， Jia LG， Cominelli F. The tumor necrosis factorlike cytokine 1A/death receptor 3 cytokine system in intestinal inflammation［J］. Curr Opin Gastroenterol， 2013， 29（6）： 597-602.

18 Pilarczyk-Zurek M， Chmielarczyk A， Gosiewski T， et al. Possible role of Escherichia coli in propagation and perpetuation of chronic inflammation in ulcerative colitis［J］. BMC Gastroenterol， 2013，13：61.

Expression of peripheral blood CD4+CD45+T cells in patients with ulcerative colitis and its clinical value

LI Yanrong, GUO Lianyi
The First Aff i liated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

GUO Lianyi. Email:angel_gly@163.com

Objective To explore the expression of peripheral blood CD4+CD45+T cells in patients with ulcerative colitis and its clinical value. Methods Eighty patients with UC in the First Aff i liated Hospital of Liaoning Medical University from March 2012 to December 2013 were selected, with mildly active in 27 cases, moderately active in 28 cases and severe active in 25 cases. There were also 80 cases in healthy control group. The fl ow cytometry was used to detect the percentage of molecules in peripheral blood T cell surface CD4+CD45+of patients. And then the percentage of the content was compared to determine the level of severity of illness. Results The expression of CD4+CD45+T cells in peripheral blood was signif i cantly higher than that of control group (52.93%±3.64% in UC group and 41.34%±2.94% in the control group, t=-22.159, P＜0.05). The expression of CD4+CD45+T cells in peripheral blood in mild activity period was 50.99%±1.45%, moderate activity period was 52.66%±1.41%, severe active stage was 55.18%±2.18%, which suggested that the moderate activity period was higher than the mild activity period, and the severe active stage was higher than the moderate activity period. Comparison between groups were statistically signif i cant with F=39.850, P＜0.05. Conclusion The expression level of peripheral blood CD4+CD45+T cells in UC group is higher than that of control group. With the aggravation of disease, the peripheral blood CD4+CD45+T cells increases signif i cantly, which has guiding sense of clinical diagnosis.

ulcerative colitis; CD4+CD45+regulatory T cells; fl ow cytometry; immune regulation

R574.1

A

2095-5227(2015)02-0127-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.009

時(shí)間：2014-11-13 17:17

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141113.1717.003.html

2014-07-07

李艷榮，女，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制。Email: 416413064@qq.com

郭蓮怡，女，博士，主任醫(yī)師，主任。Email: angel_gly@ 163.com