范曉楠 劉 梅 胡凱莉 蘇佳燦 奉建芳

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海，201203；2 第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院，上海，200433)

骨松靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

范曉楠1劉 梅1胡凱莉1蘇佳燦2奉建芳1

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心，上海，201203；2 第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院，上海，200433)

目的：建立骨松靈顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法(TLC)對(duì)復(fù)方中淫羊藿、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、熟地黃、黃芪、當(dāng)歸、鹽杜仲、醋龜甲進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)淫羊藿中淫羊藿苷、骨碎補(bǔ)中柚皮苷、熟地黃中毛蕊花糖苷、黃芪中黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：八味藥材薄層色譜圖斑點(diǎn)清晰，具有專(zhuān)屬性；淫羊藿苷在0.031 5～1.712 0 ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 7，平均回收率為100.23%，RSD為2.23%；柚皮苷在0.056 8～1.817 5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 6，平均回收率為99.97%，RSD為1.22%；毛蕊花糖苷在0.060 8～1.945 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 8，平均回收率為99.94%，RSD為1.24%；黃芪甲苷在0.467 6～11.220 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 1，平均回收率為99.84%，RSD為3.35%。結(jié)論：該方法能準(zhǔn)確可靠地進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，能有效地控制骨松靈顆粒的質(zhì)量。

骨松靈顆粒；淫羊藿苷；柚皮苷；毛蕊花糖苷；黃芪甲苷；薄層色譜；高效液相色譜

骨松靈顆粒是由淫羊藿、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、熟地黃、黃芪、當(dāng)歸、杜仲、龜甲八味藥材制成的中藥復(fù)方制劑，臨床主要用于治療骨質(zhì)疏松癥。為有效地控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)薄層鑒別和含量測(cè)定進(jìn)行了研究，分別采用TLC法對(duì)顆粒中的八味藥材進(jìn)行了薄層鑒別和HPLC法分別對(duì)淫羊藿苷、柚皮苷、毛蕊花糖苷和黃芪甲苷進(jìn)行定量測(cè)定。

1 資料與方法

1.1 儀器資料 Agilent-1100型高效液相色譜儀(Agilent Corporation)；島津SIL-20AC型高效液相色譜儀(SHIMADZU Corporation)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海千載科技有限公司)；DP-8K數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海帝魄科學(xué)儀器有限公司)；SG5200HE超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；AL-204電子天平(METTLER-TOLEDO Corporation)；JP5001電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；TLC VISUALIZER(CAMAG Corporation)；薄層色譜硅膠預(yù)制板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究院；魯Q/YT257-85)。

1.2 受試藥物 淫羊藿苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品、毛蕊花糖苷對(duì)照品、黃芪甲苷對(duì)照品、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品、當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào)分別為：110737-200415、110722-201111、111530-201309、110781-200613、110739-201115、110738-201313、120927-201315，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；杜仲對(duì)照藥材、龜甲對(duì)照藥材、膽固醇對(duì)照品(批號(hào)：121202-200502、121494-200401、111618-200301，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；骨松靈顆粒樣品(自制，批號(hào)20140718)；甲醇、正丁醇、氨水、磷酸、冰醋酸、95%乙醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、乙醚、丁酮、甲酸98%、正己烷、甲苯、濃硫酸、三氯甲烷、氯化鋁、氫氧化鉀等試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(Honey well B&J)；水為純水、超純水(上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中藥現(xiàn)代化研究中心自制)

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 淫羊藿[1]取本品0.5 g，研細(xì)，加入10 mL 95%乙醇，水浴溫浸(50 ℃)30 min，提取液濾過(guò)，得到濾液，在水浴鍋上蒸干所得的濾液，濾液蒸干后所得的殘?jiān)屑尤? mL 95%乙醇使殘?jiān)芙?，此時(shí)所得的溶液即為供試品溶液。與制備淫羊藿供試品溶液的方法相同，將缺少淫羊藿藥材的藥粉制成陰性對(duì)照溶液。用電子分析天平精密稱(chēng)定淫羊藿苷對(duì)照品適量，置于容量瓶中，加入甲醇溶解，制成濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。用玻璃點(diǎn)樣管分別吸取制備好的淫羊藿供試品溶液10 μL、缺淫羊藿藥材的陰性對(duì)照溶液10 μL、淫羊藿苷對(duì)照品溶液10 μL，將樣品溶液點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以水-丁酮-甲酸-乙酸乙酯(1-1-1-10)作為展開(kāi)劑，將點(diǎn)樣后的薄層板放置在展開(kāi)缸中進(jìn)行展開(kāi)，取出展開(kāi)好的薄層板，于通風(fēng)櫥中平放晾干揮去溶劑，并噴以AlCl3試液，于105 ℃加熱(15～20 min)至斑點(diǎn)清晰，置紫外366 nm下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 骨松靈顆粒淫羊藿薄層色譜圖

注：1淫羊藿苷對(duì)照品 2，3，4骨松靈顆粒 5陰性對(duì)照品

2.1.2 骨碎補(bǔ)[1-2]取本品約0.5 g，研細(xì)，置于圓底燒瓶中，加入甲醇30 mL，水浴(80 ℃)回流提取1 h，溶液冷卻至室溫后，提取液用濾紙進(jìn)行濾過(guò)，得到濾液，在水浴鍋上蒸干所得的濾液，在濾液蒸干后所得的殘?jiān)屑尤? mL甲醇，使殘?jiān)芙?，此時(shí)所得的溶液即為供試品溶液。參照骨碎補(bǔ)供試品溶液的制備方法，將缺少骨碎補(bǔ)藥材的藥粉制成陰性對(duì)照溶液。用電子分析天平精密稱(chēng)定柚皮苷對(duì)照品適量，置于容量瓶中，加入甲醇溶解，制成濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。用玻璃點(diǎn)樣管分別吸取制備好的骨碎補(bǔ)供試品溶液10 μL，柚皮苷對(duì)照品溶液6 μL、陰性對(duì)照品溶液10 μL，將上述3種樣品溶液點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，水-甲醇-丁酮-乙酸乙酯(1-3-6-10)作為展開(kāi)劑，在展開(kāi)缸中展開(kāi)，展開(kāi)后取出薄層板，晾干揮去溶劑，并噴以AlCl3試液，于烘箱中105 ℃加熱(15 min)至斑點(diǎn)清晰，紫外366 nm下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 骨松靈顆粒骨碎補(bǔ)薄層色譜圖

注：1柚皮苷對(duì)照品 2，3，4骨松靈顆粒 5陰性對(duì)照品

圖3 骨松靈顆粒補(bǔ)骨脂薄層色譜圖

注：1補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品 2，3，4骨松靈顆粒 5陰性對(duì)照品

2.1.3 補(bǔ)骨脂[3]取本品約5.0 g，研細(xì)，加95%乙醇30 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，水浴蒸干濾液，殘?jiān)屑尤?.5 mL甲醇使溶解，即得供試品溶液。精密稱(chēng)定異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品各1 mg，加入甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合對(duì)照品溶液。同法制成缺補(bǔ)骨脂藥材的陰性對(duì)照品溶液。用玻璃點(diǎn)樣管分別吸取補(bǔ)骨脂供試品溶液4 μL，異補(bǔ)骨脂素與補(bǔ)骨脂素的混合對(duì)照品溶液2 μL，陰性對(duì)照品溶液4 μL，將樣品溶液點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正己烷(1-6)作為展開(kāi)劑，在展開(kāi)缸中展開(kāi)，展開(kāi)后取出薄層板，晾干揮去溶劑，并噴以10%氫氧化鉀甲醇試液(顯色劑)，置紫外366 nm下觀察。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.1.4 黃芪[1]取本品約8.0 g，研細(xì)，置于圓底燒瓶中，加入甲醇25 mL，水浴80 ℃回流提取1 h，將提取液過(guò)濾，收集濾液，水浴揮去甲醇，殘?jiān)屑尤霟崴?0 mL使之溶解，冷卻至室溫后，將殘?jiān)芙夂蟮乃芤褐屑尤胗眉兯柡瓦^(guò)的正丁醇，一共萃取4次，每次均為40 mL，萃取完后，合并水飽和正丁醇提取液，然后，用氨試液一共萃取2次，每次均為40 mL，棄去氨試液，合并正丁醇萃取液，并在80 ℃水浴上揮去溶劑，殘?jiān)屑尤爰状际怪芙猓詈蠖ㄈ葜? mL容量瓶中，所得溶液即為供試品溶液。與制備黃芪供試品溶液的方法相同，將缺少黃芪藥材的藥粉制成陰性對(duì)照溶液。用電子分析天平精密稱(chēng)定黃芪甲苷對(duì)照品適量，置于容量瓶中，加入甲醇溶解，制成濃度為2.0 mg/mL的對(duì)照品溶液。用玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管分別吸取黃芪供試品溶液6 μL，黃芪甲苷對(duì)照品溶液2 μL，缺少黃芪的陰性對(duì)照品溶液6 μL，將上述3種樣品溶液點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以水-三氯甲烷-甲醇(0.3-10-3)作為展開(kāi)劑，將點(diǎn)樣后的薄層板放在展開(kāi)缸中展開(kāi)，取出展開(kāi)好的薄層板，于通風(fēng)櫥中平放晾干揮去溶劑，并噴以10%硫酸乙醇試液(顯色劑)，于烘箱中105 ℃加熱(15～20 min)至斑點(diǎn)清晰，最后日光燈下觀察斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 骨松靈顆粒黃芪薄層色譜圖

注：1黃芪甲苷對(duì)照品 2，3，4骨松靈顆粒 5陰性對(duì)照品

2.1.5 熟地黃[1,4]取本品約10.0 g，研細(xì)，加入50 mL 80%甲醇，靜置30 min，超聲處理30 min，溶液濾過(guò)，水浴蒸干濾液，殘?jiān)屑尤? mL純水使溶解，用純水飽和過(guò)的正丁醇，一共萃取4次，每次均為10 mL，合并四次水飽和的正丁醇提取液，將提取液在水浴鍋上蒸干溶劑，在蒸干溶劑后的殘?jiān)屑尤? mL甲醇溶解，所得溶液即為供試品溶液。精密稱(chēng)定毛蕊花糖苷適量，置于容量瓶中，加入甲醇溶解，制成濃度1 mg/mL的對(duì)照品溶液。同法制成缺熟地黃藥材的陰性對(duì)照品溶液。用玻璃點(diǎn)樣管分別吸取上述的熟地黃供試品溶液3 μL、毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液3 μL、缺少熟地黃的陰性對(duì)照溶液3 μL，將上述3種樣品溶液點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以甲醇-三氯甲烷(3-7)作為展開(kāi)劑，將點(diǎn)樣后的薄層板放在展開(kāi)缸中展開(kāi)，取出展開(kāi)好的薄層板，于通風(fēng)櫥中平放晾干揮去溶劑，并在薄層板上均勻噴以10%硫酸乙醇試液(顯色劑)，將噴好后的薄層板放置于105 ℃烘箱中加熱(15 min)，至斑點(diǎn)清晰后取出，在日光下觀察薄層板上的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 骨松靈顆粒熟地黃薄層色譜圖

注：1毛蕊花糖苷對(duì)照品 2，3，4骨松靈顆粒 5陰性對(duì)照品

2.1.6 當(dāng)歸[5-6]取本品約8.0 g，研細(xì)，加入30 mL乙醚，超聲15 min，將超聲所得的溶液濾過(guò)，水浴鍋上蒸干溶劑，將蒸干溶劑所得的殘?jiān)屑尤?.5 mL甲醇溶解，殘?jiān)芙馑玫娜芤杭礊楣┰嚻啡芤?。用電子天平稱(chēng)取當(dāng)歸對(duì)照藥材1.0 g，加入10 mL乙醚，參照當(dāng)歸供試品溶液的制備方法，將當(dāng)歸對(duì)照藥材制備為對(duì)照藥材溶液。將缺少當(dāng)歸藥材的藥粉參照當(dāng)歸供試品溶液的制備方法制備成陰性對(duì)照溶液。用玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管分別吸取當(dāng)歸供試品溶液10 μL，當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液5 μL，陰性對(duì)照溶液10 μL，將樣品溶液點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，用乙酸乙酯-正己烷(1∶4)作為展開(kāi)劑，將點(diǎn)樣后的薄層板放在展開(kāi)缸中展開(kāi)，取出展開(kāi)好的薄層板，于通風(fēng)櫥中平放晾干揮去溶劑，置紫外366 nm觀察薄層板上的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.1.7 杜仲[4,7]取本品約5.0 g，研細(xì)，加無(wú)水乙醇30 mL，靜置30 min，超聲處理30 min，溶液濾過(guò)，濾液減壓濃縮至0.5 mL，所得的濃縮液即為供試品溶液。用電子分析天平稱(chēng)取杜仲對(duì)照藥材約3.0 g，參照供試品溶液制備方法，將杜仲對(duì)照藥材制備為對(duì)照藥材溶液。將缺少杜仲藥材的藥粉參照杜仲供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液，備用。用玻璃點(diǎn)樣管分別吸取杜仲供試品溶液10 μL、杜仲對(duì)照藥材溶液10 μL、缺少杜仲的陰性對(duì)照溶液10 μL，將樣品溶液點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正己烷(1∶9)作為展開(kāi)劑，將點(diǎn)樣后的薄層板放在展開(kāi)缸中進(jìn)行展開(kāi)，取出展開(kāi)好的薄層板，于通風(fēng)櫥中平放晾干揮去溶劑，置紫外燈366 nm下檢查薄層板上的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖6 骨松靈顆粒當(dāng)歸薄層色譜圖

注：1當(dāng)歸對(duì)照藥材 2，3，4骨松靈顆粒 5陰性對(duì)照品

圖7 骨松靈顆粒杜仲薄層色譜圖

注：1杜仲對(duì)照藥材 2，3，4骨松靈顆粒 5陰性對(duì)照品

2.1.8 龜甲[1,8]取本品約13.0 g，研細(xì)，加入20 mL甲醇，在超聲儀上超聲30 min，將所得的溶液濾過(guò)，并在水浴鍋上蒸干所得的濾液，在濾液蒸干所得的殘?jiān)屑尤? mL甲醇溶解，所得溶液即為供試品溶液。用電子天平精密稱(chēng)定膽固醇對(duì)照品適量，置于棕色的容量瓶中，加入甲醇至刻度使溶解，制成濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。稱(chēng)定龜甲對(duì)照藥材約4.0 g，按照供試品溶液制備方法制備為龜甲對(duì)照藥材溶液。與龜甲供試品溶液的制備方法相同，將缺少龜甲藥材的藥粉制成陰性對(duì)照溶液，備用。用玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管分別吸取龜甲供試品溶液3 μL、膽固醇對(duì)照品溶液和龜甲對(duì)照藥材溶液各3 μL、缺少龜甲的陰性對(duì)照品溶液3 μL，將樣品溶液點(diǎn)樣于同一硅膠G板上，乙酸乙酯-甲酸-甲苯-甲醇(2∶0.6∶15∶1)作為展開(kāi)劑，將點(diǎn)樣后的薄層板放在展開(kāi)缸中上行展開(kāi)16 cm，取出展開(kāi)好的薄層板，于通風(fēng)櫥中平放晾干揮去溶劑，并在薄層板上均勻噴以10%硫酸乙醇試液，將噴好后的薄層板放置在105 ℃烘箱中加熱(20 min)，至斑點(diǎn)清晰后取出，于日光下觀察薄層板上的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 骨松靈顆粒龜甲薄層色譜圖

注：1膽固醇對(duì)照品 2龜甲對(duì)照藥材 3，4，5骨松靈顆粒 6陰性對(duì)照品

結(jié)論：在薄層板上，三批制劑樣品在與相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照樣品位置處有顯相同的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照樣品在此處無(wú)干擾。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件[1]淫羊藿苷：流動(dòng)相乙腈-水(30-70)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。理論塔板數(shù)按照主要成分淫羊藿苷的峰進(jìn)行計(jì)算應(yīng)不低于1500。柚皮苷：流動(dòng)相甲醇-磷酸-水(35∶4∶65)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm。理論塔板數(shù)按照主要成分柚皮苷的峰進(jìn)行計(jì)算應(yīng)不低于3000。毛蕊花糖苷：流動(dòng)相乙腈-1%醋酸(14∶86)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm。理論塔板數(shù)按照主要成分毛蕊花糖苷的峰進(jìn)行計(jì)算應(yīng)不低于5 000。黃芪甲苷[9-10]：流動(dòng)相乙腈-水(33∶67)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，蒸發(fā)溫度：100 ℃，霧化溫度：80 ℃，氮?dú)饬魉伲?.6 mL/min。理論塔板數(shù)按照主要成分黃芪甲苷的峰進(jìn)行計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)定淫羊藿苷、柚皮苷、毛蕊花糖苷、黃芪甲苷對(duì)照品適量，其中淫羊藿苷、柚皮苷、黃芪甲苷分別加入甲醇制成每毫升中含0.216 0、0.568 0、0.935 0 mg的溶液，毛蕊花糖苷加入流動(dòng)相制成每毫升中含0.243 2 mg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 1)淫羊藿苷供試品溶液：稱(chēng)取本品約1.1 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，稱(chēng)重，超聲處理1 h，再稱(chēng)重，并用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，溶液濾過(guò)，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)進(jìn)行濾過(guò)，即得。2)柚皮苷供試品溶液：稱(chēng)取本品約1.2 g，加入甲醇30 mL，置于圓底燒瓶中，加熱回流(80 ℃)3 h，冷卻至室溫，溶液濾過(guò)，濾液置于50 mL容量瓶中，用甲醇洗滌容器，洗滌的溶液倒入量瓶中，并加入甲醇稀釋至容量瓶的刻度，用微孔濾膜(0.45 μm)進(jìn)行濾過(guò)，即得。3)毛蕊花糖苷供試品溶液：稱(chēng)取本品約12.0 g，置于圓底燒瓶中，加入甲醇100 mL，稱(chēng)重，水浴80 ℃回流提取45 min，冷卻至室溫，用電子分析天平再稱(chēng)重，并用甲醇補(bǔ)足提取過(guò)程中因溶劑揮發(fā)而減失的重量，搖勻溶液后用濾紙進(jìn)行濾過(guò)，用量筒量取續(xù)濾液50 mL，水浴(80 ℃)揮干溶劑，在續(xù)濾液揮干溶劑后所得的殘?jiān)屑尤肓鲃?dòng)相進(jìn)行溶解，溶解后溶液轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，用微孔濾膜(0.45 μm)進(jìn)行濾過(guò)，即得。4)黃芪甲苷供試品溶液：稱(chēng)取本品約5.0 g，置于圓底燒瓶中，加入甲醇100 mL，水浴(80 ℃)回流提取2 h，提取液用濾紙濾過(guò)，收集濾液，并在水浴鍋上揮去濾液中的溶劑，濾液揮去溶劑后所得的殘?jiān)屑尤?0 mL熱水溶解，冷卻至室溫后，在水溶液中加入水飽和過(guò)的正丁醇，一共萃取4次，每次均為40 mL，合并所得的正丁醇提取液，然后用氨試液萃取2次，每次40 mL，棄去氨試液，合并正丁醇萃取液，并在水浴(80 ℃)上揮去溶劑，殘?jiān)蛹状歼M(jìn)行溶解，并定容至10 mL量瓶中，用微孔濾膜(0.45 μm)進(jìn)行濾過(guò)，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取2.2.2項(xiàng)下4種對(duì)照品溶液，稀釋成不同濃度，分別按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。分別以淫羊藿苷、柚皮苷、毛蕊花糖苷、黃芪甲苷濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=247.93X+0.023 7(r=0.999 7)，Y=205.14X+0.342 6(r=0.999 6)，Y=369.29X+0.140 6(r=0.999 8)，Y=1.529 3X+2.871 9(r=0.999 1)，線性范圍分別為0.031 5～1.712 0 μg，0.056 8～1.817 6 μg，0.060 8～1.945 6 μg，0.467 6～11.220 0 μg，線性關(guān)系良好。

2.2.5 專(zhuān)屬性 按2.2.3項(xiàng)下的方法，分別制備不含淫羊藿、骨碎補(bǔ)、熟地黃和黃芪的陰性對(duì)照溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果在與淫羊藿苷、柚皮苷、毛蕊花糖苷和黃芪甲苷對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上陰性對(duì)照品無(wú)干擾，表明本方法具有較好的專(zhuān)屬性。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下淫羊藿苷和柚皮苷對(duì)照品溶液各10 μL，毛蕊花糖苷和黃芪甲苷對(duì)照品溶液各20 μL，分別按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得淫羊藿苷、柚皮苷、毛蕊花糖苷、黃芪甲苷峰面積RSD分別為0.11%，0.36%，0.83%，0.65%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取淫羊藿苷和柚皮苷供試品溶液各10 μL，毛蕊花糖苷和黃芪甲苷供試品溶液各20 μL，分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果淫羊藿苷在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為3.14%；柚皮苷在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為0.67%；毛蕊花糖苷在4 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為2.32%；黃芪甲苷在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為1.86%。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取骨松靈顆粒適量，按照2.2.3項(xiàng)下方法分別制備6份淫羊藿苷、柚皮苷、毛蕊花糖苷和黃芪甲苷供試品，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算4種成分平均含量，RSD值分別為1.77%，0.73%，2.32%，0.79%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的骨松靈顆粒各9份，分別加入淫羊藿苷、柚皮苷、毛蕊花糖苷和黃芪甲苷對(duì)照品溶液適量，按照2.2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，同法進(jìn)行處理樣品，樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算樣品的加樣回收率。淫羊藿苷平均回收率為100.23%，柚皮苷平均回收率為99.97%，毛蕊花糖苷平均回收率為99.94%，黃芪甲苷平均回收率為99.84%，結(jié)果表明方法可靠。

2.2.10 樣品測(cè)定 取顆粒樣品共3批，按上述四種供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，分別在上述各色譜條件下將樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得四種指標(biāo)性成分的含量。結(jié)果如下表1。

表1 骨松靈顆粒樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

淫羊藿、骨碎補(bǔ)、熟地黃、黃芪是本方中的君臣藥。淫羊藿中的淫羊藿苷等黃酮類(lèi)成分具有抑制破骨細(xì)胞形成[11]；骨碎補(bǔ)中柚皮苷等黃酮類(lèi)成分具有提高骨密度，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[12]；熟地黃提取物能提高成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性及成骨細(xì)胞的增殖[13]；黃芪總黃酮能明顯抑制骨礦物質(zhì)的溶解和丟失[14]；故選擇淫羊藿中的淫羊藿苷、骨碎補(bǔ)中的柚皮苷、熟地黃中的毛蕊花糖苷、黃芪中的黃芪甲苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

骨碎補(bǔ)的鑒定研究方法按照2010版藥典中展開(kāi)劑的條件進(jìn)行展開(kāi)，結(jié)果在柚皮苷對(duì)照品的相應(yīng)位置處樣品無(wú)斑點(diǎn)，采用本實(shí)驗(yàn)中展開(kāi)劑條件后，斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，且陰性無(wú)干擾。黃芪的鑒定研究方法按照2010版藥典的檢測(cè)方法制樣，以黃芪甲苷為對(duì)照，結(jié)果陰性對(duì)照有干擾，經(jīng)摸索條件后，按照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行展開(kāi)，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。熟地黃的鑒定研究方法按照2010版藥典的檢測(cè)方法制樣展開(kāi)，以毛蕊花糖苷為對(duì)照，結(jié)果供試品色譜圖斑點(diǎn)分不開(kāi)，且陰性有干擾；參照文獻(xiàn)中展開(kāi)劑條件進(jìn)行展開(kāi)，斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，且陰性無(wú)干擾。當(dāng)歸的鑒定研究方法按照2010版藥典的檢測(cè)方法未有斑點(diǎn)，參考文獻(xiàn)中鑒別方法，結(jié)果斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，且陰性無(wú)干擾。

在定量測(cè)定中，分別對(duì)供試品溶液制備中的提前方法、提取溶劑、提取時(shí)間進(jìn)行了考察，最終確定本文中供試品的處理方法。

采用《中國(guó)藥典》2010年版一部中淫羊藿藥材中淫羊藿苷含量測(cè)定色譜條件對(duì)本品中淫羊藿苷含量進(jìn)行測(cè)定，色譜峰分離較好，峰形對(duì)稱(chēng)，適合本品中淫羊藿苷的含量測(cè)定；按照藥典流動(dòng)相條件(甲醇-醋酸-水)測(cè)定柚皮苷，峰有拖尾現(xiàn)象，將流動(dòng)相改為甲醇-磷酸-水，峰形較好，適合本品中柚皮苷的含量測(cè)定；按照藥典，毛蕊花糖苷流動(dòng)相條件為乙腈-0.1%醋酸(16∶84)，色譜峰分離不好，峰形拖尾，調(diào)整流動(dòng)相條件為乙腈-1%醋酸(14∶86)，色譜峰分離較好；按照藥典，黃芪甲苷流動(dòng)相比例為乙腈-水(32∶68)，色譜峰分離不好，調(diào)整流動(dòng)相比例為(33∶67)，色譜峰分離較好。

由毛蕊花糖苷穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛蕊花糖苷穩(wěn)定性較差[15]，供試品應(yīng)在制備后4 h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定。

本研究采用TLC法定性鑒別8味藥材的特征斑點(diǎn)明顯，HPLC法測(cè)定4種指標(biāo)性成分含量的方法較簡(jiǎn)便，且穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可有效控制骨松靈顆粒的質(zhì)量。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2]李德勛.壯骨關(guān)節(jié)丸中淫羊藿、骨碎補(bǔ)的薄層色譜鑒別[J].中成藥,2003,25(8):682-683.

[3]馮瑪莉,高鳳福.龜齡集中補(bǔ)骨脂的薄層色譜鑒別[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,6(2):44-45.

[4]朱希,尹華,李月,等.補(bǔ)腎活血顆粒的薄層色譜研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,24(4):33-37.

[5]劉志承,李曙光,劉紀(jì)青,等.軟肝顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中藥材,2010,33(10):1649-1651.

[6]王宇紅,周新蓓.脂清膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2007,18(3):641-642.

[7]張子華.歸腎丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,20(2):153-156.

[8]張永太,李國(guó)文,馮年平,等.麗妍軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2008,28(7):582-583.

[9]田景奎,吳麗敏,劉建建,等.HPLC-ELSD測(cè)定芪休顆粒中黃芪甲苷的含量[J].中成藥,2004,26(10):812.

[10]聶穎蘭,范斌,郭娜,等.HPLC-ELSD法測(cè)定健脾益腎膠囊中黃芪甲苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(17):130.

[11]趙麗娜.淫羊藿防治骨質(zhì)疏松臨床效果評(píng)價(jià)[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2003,12(9):922-923.

[12]周繼凱.中藥骨碎補(bǔ)對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制研究[D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2007.

[13]李雪靖,郭鴻.原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)藥治療概況[J].河北醫(yī)藥,2010,32(20):2913.

[14]陳華庭,王虎,鄭菁,等.黃芪總黃酮提取物對(duì)維甲酸所致大鼠骨質(zhì)疏松的影響[J].中國(guó)藥師,2005,8(11):895-897.

[15]彭素萍,鞏珺,苗瑞娟,等.連翹酯苷B與毛蕊花糖苷穩(wěn)定性研究[J].今日藥學(xué),2012,22(6):326-328.

(2015-04-14收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

The Study of the Quality Standard of Gusongling Granules

Fan Xiaonan1,Liu Mei1,Hu Kaili1,Su Jiacan2,Feng Jianfang1

(1ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，MuradResearchCenterofModernizedChineseMedicine，Shanghai201203，China；2TheSecondMilitaryMedicalUniversityforChanghaiHospital，Shanghai200433，China)

Objective:To establish the quality standard for Gusongling Granules. Methods: TLC was performed to identify the qualification of Epimedii Folium(Yinyanghuo), Drynarial Rhizoma(Gusuibu), Psoraleae Fructus(Buguzhi), Rehmanniae Radix Praeparata(Shudihuang), Astragali Radix(Huangqi), Angelicae Sinensis Radix(Danggui), Eucommiae Cortex(Yanduzhong), Testudinis Carapax Et Plastrum(Cuguijia). Besides, a HPLC method was established for the determination of icariine, naringin, acteoside, and astragaloside. Results: The spots on TLC plates were clear with specificity. Icariin showed a good linear relationship at a range between 0.0315 and 1.7120 μg, r=0.9997, the average recovery was 100.23%, and RSD was 2.23%. Naringin showed a good linear relationship at a range between 0.0568 and 1.8175 μg, r=0.9996, the average recovery was 99.97%, and RSD was 1.22%. Acteoside showed a good linear relationship at a range between 0.0608 and 1.9456 μg, r=0.9998, the average recovery was 99.94%, and RSD was 1.24%. Astragaloside showed a good linear relationship at a range between 0.4676 and 11.2200 μg, r=0.9998, the average recovery was 99.84%, and RSD was 3.35%. Conclusion: This method can be accurate and reliable in qualitative and quantitative detection, and can control the drug quality effectively.

Gusongling Granules; Icariine; Naringin; Acteoside; Astragaloside; TLC; HPLC

上海市科委中藥現(xiàn)代化專(zhuān)項(xiàng)(編號(hào):12401900703)

范曉楠(1988.9—)，女，碩士，研究方向：中藥新型給藥系統(tǒng)研究，E-mail：fanxn2007@163.com

奉建芳(1966.4—)，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥新型給藥系統(tǒng)研究，E-mail：fengjianfang@vip.tom.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.10.038