趙 剛 夏 瑩 黃志軍 裴學(xué)軍 唐惠丹

(1 健民集團兒童藥物研究院,武漢,430052; 2 湖北省食品藥品安全評價中心,武漢,430073)

健脾生血顆粒對大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究

趙 剛1夏 瑩2黃志軍1裴學(xué)軍1唐惠丹1

(1 健民集團兒童藥物研究院,武漢,430052; 2 湖北省食品藥品安全評價中心,武漢,430073)

目的:評價灌胃給予健脾生血顆粒對大鼠胚胎-胎仔發(fā)毒性作用。方法:孕鼠隨機分為陰性對照、陽性對照和低、中、高劑量試驗組,分別于孕期第6至第15天連續(xù)灌胃給藥。其中,低、中、高劑量試驗組分別灌胃健脾生血顆粒浸膏1.16、3.48、10.44 g/kg/d,陽性對照組灌胃維生素A醋酸酯0.08 g/kg/d,陰性對照組給予同樣體積的純凈水。記錄孕鼠的體重、身長、攝食量及臨床表現(xiàn)。于妊娠第20天剖檢孕鼠,觀察胎盤和胎鼠外觀形態(tài),記錄黃體數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎、著床數(shù)及胎盤質(zhì)量,制作骨骼和內(nèi)臟標(biāo)本,以作進一步檢查。結(jié)果:陽性對照組出現(xiàn)了明顯的致畸作用,證明本試驗系統(tǒng)結(jié)果可靠。試驗組大鼠經(jīng)給藥后,均未見明顯異常臨床癥狀,各劑量組對胚胎的形成均無明顯影響,且黃體數(shù)、植入數(shù)、死胎、活胎以及吸收胎與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。此外,低、中劑量的浸膏對親代大鼠未見明顯一般毒性,但高劑量浸膏可致親代大鼠體重和攝食量下降,影響部分胎鼠的發(fā)育,主要表現(xiàn)為體重減輕,少數(shù)動物關(guān)節(jié)畸形等。結(jié)論:在本試驗條件下,健脾生血顆粒浸膏對大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性的無不良反應(yīng)劑量為3.48 g/kg,相當(dāng)于成人臨床最大用量的42倍。

健脾生血顆粒;大鼠;胚胎-胎仔發(fā)育毒性

安全性研究是新藥開發(fā)和老產(chǎn)品二次開發(fā)的重點內(nèi)容。由于歷史等原因,國內(nèi)較多上市產(chǎn)品并未嚴格按照GLP的規(guī)范對藥物安全性進行全面研究,尤其是10年前批準(zhǔn)生產(chǎn)的藥品,即使進行了相關(guān)安全性評價研究,當(dāng)時的評價基礎(chǔ)和研究技術(shù)也難以滿足當(dāng)今的技術(shù)要求[1]。隨著藥品進入市場后大規(guī)模的應(yīng)用檢驗,上市產(chǎn)品的安全性問題逐漸暴露[2]。因此,國家鼓勵藥企對已批準(zhǔn)生產(chǎn)的藥品進行上市后再評價研究,尤其是安全性評價研究[3]。同時,可靠的安全性再評價研究數(shù)據(jù)也能為上市產(chǎn)品提供學(xué)術(shù)推廣資料。讓醫(yī)療工作者對產(chǎn)品的認識更加深入,更加放心地去選擇產(chǎn)品。

健脾生血顆粒和健脾生血片是健民藥業(yè)集團股份有限公司獨家生產(chǎn)的中西復(fù)方制劑,二者僅有劑型差別,處方一致,主要成分為黨參、茯苓、黃芪、山藥、雞內(nèi)金、龜甲、大棗等中藥成分及硫酸亞鐵,功能主治為健脾和胃,養(yǎng)血安神,用于小兒脾胃虛弱及心脾兩虛型缺鐵性貧血,以及成人氣血兩虛型缺鐵性貧血。該產(chǎn)品以中醫(yī)經(jīng)典方“參苓白術(shù)散”“生脈飲”及“龍骨牡蠣湯”為基礎(chǔ)化裁而得,可顯著改善缺鐵性貧血患者脾胃運化功能,并具益氣養(yǎng)血之功[4-5]。目前,該產(chǎn)品在臨床上主要用于妊娠期婦女和小兒缺鐵性貧血的治療與預(yù)防,以及改善體弱成人的氣虛、脾虛等癥狀。由于該產(chǎn)品在妊娠期婦女患者中應(yīng)用較為廣泛[6-8],所以為了更進一步明確該產(chǎn)品的不良反應(yīng),保證孕婦和胎兒安全,本研究擬采用SPF級SD大鼠,探討健脾生血顆粒浸膏對胚胎-胎仔發(fā)育的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 藥品 健脾生血顆粒浸膏,由健民藥業(yè)集團股份有限公司提供(批號:140111-18),每克浸膏相當(dāng)于生藥材3.3 g,含七水硫酸亞鐵0.154 g。維生素A醋酸酯,購于國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司(批號:10132001)。溶劑對照為飲用純凈水,由武漢神陽飲品有限公司提供。

1.2 動物及分組 SD大鼠,SPF級,購于湖北省實驗動物研究中心,生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2008-0005,實驗動物質(zhì)量合格證號:42000600002944。交配開始前,所有動物均適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d,動物年齡為10～11周齡,雌鼠體重200～270 g,雄鼠體重310～400 g。動物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)的IVC籠具中,動物房實行壓差及溫濕度監(jiān)控和自動控制。相對濕度控制范圍為39%至55%,溫度控制范圍為20.1 ℃至23.7 ℃。IVC籠內(nèi)每小時換氣次數(shù)40次以上,光照明10 h/暗14 h,循環(huán)交替至實驗結(jié)束。動物飼料由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供。動物飲用水為經(jīng)高壓滅菌消毒的瓶裝水。將雌鼠、雄鼠1∶1合籠,次日檢查陰栓及陰道涂片,精子與陰栓同存者即被判斷為交配成立,當(dāng)日記為妊娠0日。將交配成功的孕鼠隨機分為5組,即溶劑對照組、陽性對照組和低、中、高劑量試驗組,每組20～22只。其中,溶劑對照組灌胃純凈水,陽性對照組灌胃0.08 g/kg/d維生素A醋酸酯,低、中、高劑量試驗組分別灌胃健脾生血顆粒浸膏1.16、3.48、10.44 g/kg/d。給藥體積均為10 mL/kg。每組均從妊娠第6天給藥至妊娠第15天,給藥1次/d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 存活期檢查從動物到達至動物解剖當(dāng)日,每天進行2次存活性觀察及籠邊觀察,觀察動物存活情況、體征變化、行為等。體重稱量從試驗前即開始,稱重1次/3 d。孕鼠分別在妊娠第0、7、14、20天測定攝食量。

1.3.2 終點檢查剖檢前,采用2%戊巴比妥鈉麻醉實施安樂死,所有動物均對體表、天然孔道和腦外表面進行檢查。孕鼠于妊娠第20天處死。觀察胎盤,稱取卵巢、子宮及所有附著的胎仔總重,計數(shù)黃體數(shù),活胎、死胎、吸收胎并計算著床數(shù)。胎仔剖檢前,以戊巴比妥鈉(5～20 mg/胎仔)腹腔注射安樂死。測量活胎胎仔體重、頂臀長,并通過內(nèi)外生殖器辨別胎仔性別。部分胎仔經(jīng)Bouin氏液固定[9],以作內(nèi)臟檢查,部分胎仔經(jīng)剝皮后用茜素紅染色[10],以作骨骼檢查。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有定量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料采用t檢驗分析,計數(shù)資料采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不良反應(yīng) 動物死亡及臨床情況本實驗中未觀察到因供試品引起的臨床癥狀或死亡。

圖1 健脾生血顆粒浸膏對孕鼠攝食量的影響

注:與同類陰性對照組相比,**P<0.01。

圖2 健脾生血顆粒浸膏對孕鼠體量的影響

注:與同孕天數(shù)的陰性對照組相比,**P<0.01。

2.2 孕鼠攝食量和體重健脾生血顆粒浸膏對孕鼠攝食量的影響 見圖1。由圖可見,健脾生血顆粒浸膏低、中劑量組攝食量相對于陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),高劑量組攝食量顯著低于陰性對照組,陽性對照組給藥后孕7 d至孕20 d的攝食量顯著低于陰性對照組。

大鼠隨孕天數(shù)增加的體重情況見圖2。由圖可見,低、中劑量的健脾生血顆粒浸膏對孕鼠體重?zé)o明顯影響。健脾生血顆粒浸膏高劑量組給藥后于孕9 d至孕20 d孕鼠體重顯著低于陰性對照組。

2.3 胚胎毒性 通過對孕鼠黃體數(shù)、植入數(shù)、著床率、死胎率等指標(biāo)觀察可見,健脾生血顆粒浸膏各劑量組對胚胎形成無明顯影響,各組黃體數(shù)、植入數(shù)、死胎、活胎、吸收胎等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。健脾生血顆粒浸膏對胎鼠外觀的影響見表1。由表可見,健脾生血顆粒浸膏各給藥組胎鼠身長、尾長及低、中劑量組胎鼠平均體重、身長與陰性對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),高劑量組胎鼠平均體重顯著低于陰性對照組。包括陰性對照組在內(nèi)各組可見1～3例皮下出血,健脾生血顆粒浸膏各給藥組胎鼠外觀均無畸形。

通過對胎鼠骨骼的檢查發(fā)現(xiàn),高劑量的健脾生血顆粒浸膏可導(dǎo)致胎鼠骨骼發(fā)育延遲,主要表現(xiàn)為囟門閉合不全,枕骨、胸骨、四肢骨骨化不全、脊椎骨彎曲等。結(jié)果見表2。經(jīng)頭部徒手切片及其他新鮮內(nèi)臟檢查,評價健脾生血顆粒浸膏對胎鼠內(nèi)臟的影響,結(jié)果表明,各試驗組均可見少數(shù)胎鼠內(nèi)臟異常。與陰性對照組相比,低、中、高劑量的健脾生血顆粒浸膏組差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而陽性對照組明顯影響胎鼠內(nèi)臟發(fā)育,主要表現(xiàn)為眼缺失、腎積水、腦室萎縮等。

3 討論

本研究為健脾生血顆粒(片)二次開發(fā)研究內(nèi)容的一部分,嚴格按照GLP操作規(guī)范對產(chǎn)品的生殖毒性進行評價。結(jié)果顯示,陽性對照品維生素A醋酸酯0.08 g/kg經(jīng)口灌胃給藥后出現(xiàn)明顯致畸作用,表現(xiàn)為骨化不全、骨缺失、內(nèi)臟積水、眼缺失等,說明本實驗系統(tǒng)結(jié)果可靠。綜合評價各試驗結(jié)果可見,低、中劑量的健脾生血顆粒浸膏對親代大鼠和子代胎鼠均無明顯毒性;高劑量的健脾生血顆粒浸膏可導(dǎo)致親代大鼠體重和攝食量下降,影響部分胎鼠的發(fā)育,主要表現(xiàn)為體重減輕,少數(shù)動物關(guān)節(jié)畸形等。因此,在本實驗條件下,健脾生血顆粒浸膏未見毒性作用劑量為3.48 g/kg。以人體質(zhì)量60 kg計算,約相當(dāng)于人臨床最大用量的42倍、12歲以下兒童臨床最大用量的30倍。

健脾生血顆粒是由13味中藥和西藥硫酸亞鐵組成的復(fù)方制劑,通過文獻查閱,中藥部分并無毒性藥材[11-15]。分析處方,硫酸亞鐵成分可能在高劑量組產(chǎn)生毒性作用中占主導(dǎo)角色。但健脾生血顆粒浸膏劑量在3.48 g/kg以下時,對孕鼠親、子代均無不良反應(yīng)。提示患者按正常劑量服用本品時,對妊娠期婦女和胎兒是安全的,尤其是對于鐵缺乏的缺鐵性貧血患者,吸收的鐵經(jīng)血紅蛋白利用后,循環(huán)鐵和結(jié)合鐵相對更少。但為保證安全,不應(yīng)額外再服用其他鐵制劑。本研究結(jié)果作為生殖毒性試驗研究的一部分,結(jié)合生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗和圍產(chǎn)期毒性試驗研究,將對產(chǎn)品在妊娠期婦女缺鐵性貧血治療中的安全性提供重要參考。同時,本研究模式也可為其他品種的上市后再評價提供借鑒。

表1 健脾生血顆粒浸膏對胎鼠外觀的影響(Mean±SD)

注:與同類陰性對照組相比,**P<0.01。

表2 健脾生血顆粒浸膏對胎鼠骨骼的影響

注:與同類陰性對照組相比,**P<0.01。

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(2015-08-26收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effect of Invigorating Spleen-Generating Blood Granule on Embryo-fetal Development of Rats

Zhao Gang1, Xia Ying2, Huang Zhijun1, Pei Xuejun1, Tang Huidan1

(1AcademyofPediatricDrugs,JianminPharmaceuticalGroup,Wuhan430052,China; 2CenterofFoodandDrugSafetyEvaluationinHubei,Wuhan430073,China)

Objective: To investigate the effects of Invigorating Spleen-Generating Blood Granule on embryo-fetal development of rats after intragastric administration. Methods: Pregnant rats were randomly divided into five groups: negative control, positive control, treatment groups with low, medium, or high dosage. The control groups were given oral administration with extract of the granule at 1.16、3.48、10.44 g/kg/d respectively for 10 days after six days' pregnancy. The positive control group were given Vitamin A acetate at 0.08 g/kg/d；the negative group were given pure water with same volume. Then the weight, body length, food consumption, and clinical features of pregnant rats were recorded. Pregnant rats were dissected at their 20 days' pregnancy. Then placentas, fetal rat appearances, skeleton, viscera, and numbers of corpus luteum, live fetus, dying fetus, absorbed fetus, implantation and other factors were recorded. Results: Obvious teratogenesis appeared in positive control rats, showed the reliability of the experiment. No abnormal clinical symptoms were observed in the rats of all treatment groups. There were no statistical differences of numbers of corpus luteum, live fetus, dying fetus, absorbed fetus, and implantation among the rats of all treatment groups and negative control. No general toxicity was found from rats with low or medium dosage. But high dosage of extract may result in a decline of weight, and food consumption. Furthermore, the development of fetal rats was also affected. Conclusion: The safe dosage of Invigorating Spleen-Generating Blood Granule on embryo-fetal development of rats was under 3.48 g/kg, 42 times of clinical dosage on human.

Invigorating Spleen-Generating Blood Granule; Rat; Toxicity on embryo-fetal development

武漢市科技攻關(guān)計劃項目(編號:2013070204020053)

趙剛(1983.10—)，男,博士,高級工程師,從事兒童藥物新藥開發(fā)與藥理毒理研究,E-mail:zhaogangsna@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.10.034