韓俊閣 劉曉燕 張劉扛 郭霞珍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

“肺與大腸相表里”機(jī)理的研究
——高氧刺激對肺腸黏膜免疫因子含量表達(dá)的影響

韓俊閣 劉曉燕 張劉扛 郭霞珍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

目的：通過觀察高氧下大鼠肺、腸黏膜細(xì)胞因子IL-1β，IL-2、IL-6、TNF-α含量的變化，探討“肺與大腸相表里”的生物學(xué)機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)設(shè)立正?？諝饨M、高氧組(吸入40%濃度氧)，比較2組肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液中IL-1β，IL-2、IL-6、TNF-α的含量。結(jié)果：造模5 d后，大鼠肺泡灌洗液和腸黏膜灌洗液中的IL-1β、IL-2、IL-6含量均較正?？諝饨M呈現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；大鼠肺泡灌洗液及腸黏膜灌洗液的TNF-α也表現(xiàn)為較正?？諝饨M下降的趨勢(P>0.05)。結(jié)論：肺腸之間在黏膜免疫方面具有同步性，這可能是肺與大腸表里關(guān)系的重要的生物學(xué)基礎(chǔ)。

肺與大腸相表里；高氧；細(xì)胞因子

臟腑表里相關(guān)理論是中醫(yī)學(xué)藏象學(xué)說的基本內(nèi)容，“肺合大腸”的理論基礎(chǔ)最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《靈樞·本輸篇》言：“肺合大腸，大腸者，傳道之府”。肺為臟屬陰，大腸為腑屬陽，二者一臟一腑，一陰一陽，互為表里，相合為用。其表里關(guān)系，首先表現(xiàn)為經(jīng)脈上，手陽明大腸經(jīng)與手太陰肺經(jīng)相互絡(luò)屬，見于《靈樞·經(jīng)脈》：“肺手太陰之脈，……下絡(luò)大腸，上膈屬肺……”；“大腸手陽明之脈，……下入缺盆絡(luò)肺，下膈屬大腸……”[1]；其次，功能上，肺“主氣、司呼吸”“通調(diào)水道”，為“水之上源”，大腸為“傳導(dǎo)之官”，“主津”。肺主宣發(fā)、肅降功能正常，則津液得以布散，腸道得以濡潤，大腸傳導(dǎo)輸化糟粕功能正常，以此共同參與水液代謝、運(yùn)行氣機(jī)、傳導(dǎo)水谷等功能。生理上的相互聯(lián)系與功能配合，一旦發(fā)生異常，必會引起病理上的互相影響。目前關(guān)于肺與大腸的表里關(guān)系的研究，多從臨床病理方面進(jìn)行論述與發(fā)現(xiàn)，臨床上常常見肺病及腸和腸病及肺的現(xiàn)象，但肺腸之間病理聯(lián)系的具體機(jī)制尚未明確。因此，本研究擬通過觀察高氧刺激對實(shí)驗(yàn)動物肺腸黏膜免疫因子IL-1β，IL-2、IL-6、TNF-α含量表達(dá)的影響，試從免疫學(xué)角度探討肺與大腸表里相關(guān)理論的實(shí)質(zhì)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

1.1.1 動物 健康雌性SD大鼠，16只，體重(200±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司購入。飼料由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供的普通鼠全價顆粒飼料。

1.1.2 儀器與試劑 飼養(yǎng)箱-代謝籠式可變氧飼養(yǎng)箱(自主設(shè)計)；測氧儀(CW-2000QR，北京精微恒測氧技術(shù)開發(fā)中心)；瓶裝氧氣與氮?dú)?北京朝紅平氣體有限公司)；低溫高速離心機(jī)(美國Beckman公司)；全自動洗板機(jī)(Pw-96OA，深圳匯松)；酶標(biāo)儀(Rayto RT-6000)。IL-1β，IL-2、IL-6、TNF-α試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為高氧組、正常空氣組，每組各8只。

高氧組大鼠放置于氧濃度為40%(精度±0.5%)的自制封閉氧箱飼養(yǎng)，氧箱上部的接口，用來連接測氧儀，氧箱的兩側(cè)分別設(shè)有接口，一側(cè)接口連接氧氣和氮?dú)?，另一?cè)接口排氣，以保持氧箱內(nèi)外大氣壓基本一致；將大鼠提前一周入氧箱進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，期間氧箱開啟，正常攝取食水，正式造模后，封閉氧箱，自然光照，自由攝取食水，控制氧濃度40%(精度±0.5%)，濕度50%～70%，溫度22～25 ℃，每天中午定時開箱通氣1 h，添加食水，鈣石灰吸收CO2，更換墊料，連續(xù)飼養(yǎng)5 d。正?？諝饨M大鼠置于正?？諝鈼l件下飼養(yǎng)，自然光照，濕度50%～70%，溫度22～25 ℃，自由攝取食水。

1.2.2 取材 肺泡灌洗液:將大鼠戊巴比妥鈉麻醉固定，腹主動脈取血后處死，隨即開胸，暴露氣管，用手術(shù)線結(jié)扎離心端，在其下方兩個軟骨環(huán)間作一切口，插入導(dǎo)管，導(dǎo)管與5 mL注射器連接，在支氣管分叉處用手術(shù)線結(jié)扎右側(cè)支氣管，用磷酸鹽緩沖液(PBS)4 mL進(jìn)行左肺灌洗，注射器抽吸6遍，回收液約為2～2.5 mL，將回收液在4 ℃低溫離心機(jī)上離心，3 000 r/min，離心15 min，收集上清液，-20 ℃低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

腸黏膜粘液:將大鼠戊巴比妥鈉麻醉固定，腹主動脈取血后處死，取盲腸上部5 cm處回腸10 cm，用冷雙蒸水和PBS液依次流動沖洗后平鋪于定性濾紙上，沿回腸縱軸剪開，再用PBS液沖洗，用清潔蓋玻片輕輕刮取腸黏膜表面粘液，用凍存管收集刮取腸黏膜粘液，加入適量PBS液并小心攪拌使其充分溶解，在4 ℃低溫離心機(jī)上離心，3 000 r/min，離心15 min，收集上清液-20 ℃低溫冰箱儲存?zhèn)錂z。

1.2.3 指標(biāo)檢測 將收集的肺泡灌洗液和腸黏膜灌洗液，分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測其中IL-1β，IL-2、IL-6、TNF-α含量。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-1β表達(dá)的比較 與正?？諝饨M的測定值比較，在高氧狀態(tài)下的大鼠肺泡灌洗液和腸黏膜灌洗液的IL-1β含量表達(dá)，均呈現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，兩者變化具有一致性。結(jié)果見表1。

表1 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-1β 表達(dá)的比較

注：與正常空氣組比較，**P<0.01。

2.2 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-2表達(dá)的比較 與正常空氣組的測定值相比較，在高氧狀態(tài)下的大鼠肺泡灌洗液和腸黏膜灌洗液的IL-2含量表達(dá)，均明顯呈現(xiàn)下降(P<0.05)，兩者變化具有一致性。結(jié)果見表2。

表2 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-2 表達(dá)的比較

注：與正?？諝饨M比較，**P<0.01，*P<0.05。

2.3 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-6表達(dá)的比較 與正?？諝饨M的測定值相比較，在高氧狀態(tài)下的大鼠肺泡灌洗液的IL-6表達(dá)，明顯呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05)；大鼠腸黏膜灌洗液的IL-6表達(dá)也呈現(xiàn)下降趨勢，但與正?？諝饨M大鼠腸黏膜灌洗液的IL-6表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-6 表達(dá)的比較

注：與正?？諝饨M比較，*P<0.05。

2.4 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液TNF-α表達(dá)的比較 與正?？諝饨M的測定值相比較，在高氧狀態(tài)下的大鼠肺泡灌洗液及腸黏膜灌洗液的TNF-α表達(dá)，均呈現(xiàn)出下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液TNF-α 表達(dá)的比較

3 討論

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)臟腑相關(guān)理論的重要組成部分。不僅因?yàn)榻?jīng)絡(luò)上手陽明大腸經(jīng)與手太陰肺經(jīng)相互絡(luò)屬，更因?yàn)榉巍⒛c生理、病理上的相互聯(lián)系與影響。生理上，肺主宣發(fā)、肅降，其功能的正常發(fā)揮有助于腸道傳導(dǎo)功能的行使；大腸為“傳導(dǎo)之官”，其傳導(dǎo)功能正常反過來有利于肺氣的宣降。病理上，常常可見到肺病及腸和腸病及肺的現(xiàn)象，不但歷代典籍較多著述，如《素問·咳論》曰：“肺咳不已，則大腸受之……”；又《黃帝內(nèi)經(jīng)靈樞集注·卷五》云：“大腸為肺之腑而主大便，邪痹于大腸，故上則為氣喘爭，而下為飧瀉也。故大腸之病，亦能上逆而反遺于肺?！碧谱诤！吨形鲄R通醫(yī)經(jīng)精義·臟腑所合》論曰：“蓋邪熱不從大便而瀉，上壅于喉，宜瀉大腸，此大腸所以為傳道肺氣之府也。”[2]在臨床上，肺病及腸、腸病及肺也是常見的病理現(xiàn)象，治療則可通過肺病治腸、腸病治肺來實(shí)現(xiàn)；如哮喘發(fā)作期及COPD急性發(fā)作期的患者，多合并排便異常，或便結(jié)不通，或泄瀉下利[3-4]，通過“通腑”“降瀉”“利氣”“除壅”等治法，多能達(dá)到良好治療效果；郜巒[5]通過對肺、腸相互致病的相關(guān)有效文獻(xiàn)檢索統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在便秘、泄瀉等腸系疾病發(fā)生的患者中，咳嗽、喘促等肺系癥狀出現(xiàn)的頻率均大于20%；慢性結(jié)腸炎大腸濕熱型，通過清肺、解毒、除濕之法治療，往往收到良好療效[6]；老年性便秘，從補(bǔ)肺潤肺健脾著手，則療效顯著[7]；而應(yīng)用大承氣湯通腑泄?jié)嵋嗄芨纳坪粑狡染C合征實(shí)驗(yàn)動物的肺組織病變情況及提高動脈氧分壓[8]。但是，關(guān)于肺與大腸表里關(guān)系的內(nèi)在生物學(xué)機(jī)理，目前尚不明確。

體表黏膜屏障，作為抵御外來抗原的第一道防線，當(dāng)機(jī)體受到外界條件的刺激或影響時，首先出現(xiàn)相應(yīng)的改變。研究表明，呼吸道、胃腸道連同泌尿生殖道黏膜等，共同執(zhí)行局部特異性免疫功能，并通過淋巴系統(tǒng)歸巢發(fā)生聯(lián)系，構(gòu)成黏膜免疫系統(tǒng)[9]。該系統(tǒng)中黏膜局部的免疫細(xì)胞在刺激條件下合成和分泌細(xì)胞因子(CK)，包括白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN)等物質(zhì)，作為細(xì)胞間信號傳遞分子，主要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與免疫細(xì)胞分化發(fā)育、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與組織修復(fù)等多種功能[10]。在“肺與大腸相表里”的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1、TNF-α在肺病(哮喘)、腸病(便秘)大鼠血清中含量均顯著高于正常對照組大鼠，但肺腸合病(哮喘合并便秘)大鼠血清中其含量顯著高于單純肺病或腸病組，由此認(rèn)為IL-1、TNF-α可能是肺與大腸相關(guān)的共同物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。

組織胚胎學(xué)研究已證實(shí)，肺、氣管由原腸的前腸發(fā)展而成，因此，肺、氣管與腸的結(jié)構(gòu)來源相同，可被認(rèn)為是“肺合大腸”的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[12]；而我們的前期研究顯示，肺與大腸相表里在組織發(fā)生學(xué)上表現(xiàn)為肺與回腸、結(jié)腸的組織同源性[13]，因此本實(shí)驗(yàn)選取肺泡灌洗液與回腸黏膜灌洗液進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高氧(40%氧濃度)條件下，大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液中IL-1β、IL-2、IL-6含量的表達(dá)，與正?？諝饨M大鼠比較，均呈現(xiàn)明顯降低(P<0.05)。而且在高氧條件下，細(xì)胞因子TNF-α無論在大鼠肺泡灌洗液還是在腸黏膜灌洗液中含量的表達(dá)，也都表現(xiàn)為較正常空氣組下降的趨勢。由此表明，肺與大腸在高氧刺激下表現(xiàn)為黏膜免疫功能的共同下降。

吳氏等在實(shí)驗(yàn)研究中也顯示[14]，實(shí)驗(yàn)動物在吸入高濃度氧后，血清、肺組織及肺泡灌洗液中細(xì)胞因子的表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)的變化，表現(xiàn)為細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-6及TNF-α等出現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化趨勢，高峰時間多在24 h，而48～72 h后逐漸下降，說明細(xì)胞因子在機(jī)體急性刺激早期階段應(yīng)激性升高，而隨著高氧暴露時間延長，免疫力逐漸降低，細(xì)胞因子表達(dá)開始下降；而TNF-α為機(jī)體前炎性細(xì)胞因子，主要參與早期炎癥反應(yīng)過程，同時能促進(jìn)其他細(xì)胞因子如白介素的分泌，因此在慢性高氧刺激后期變化趨勢不明顯[15]。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同樣支持這一結(jié)果：本研究中實(shí)驗(yàn)大鼠是在40%氧濃度下飼養(yǎng)5 d，屬于慢性高氧刺激，因此其肺、腸黏膜分泌IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α的含量表現(xiàn)出了較正常空氣組均減低，其中IL-1β、IL-2、IL-6的降低更顯著。

綜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高氧刺激影響機(jī)體的免疫功能，慢性高氧使肺的免疫功能降低，而腸的免疫功能隨之也相應(yīng)降低。由此說明，肺腸之間在黏膜免疫方面具有同步性，這為中醫(yī)“肺與大腸相表里”的理論提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2014-06-20收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Mechanism Research on ‘Lung and Large Intestine being interior-exteriorly Related’——Effect of Hyperoxia on the Expression of CK of Lung and Intestinal Mucosa

Han Junge,Liu Xiaoyan,Zhang Liukang,Guo Xiazhen

(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,N0.11EastRoadofNorth3rdRingRoad,Beijing100029,China)

Objective:To observe the hyperoxia stimulus to lung and intestinal mucosa of rats and the changes of the content of cytokines IL-1beta,IL-2,IL-6,TNF alpha,so as to explore the biological mechanisms of ‘Lung and Large Intestine being interior-exteriorly related’.Methods:The experiment set up two groups-normal group and the hyperoxia one-which the oxygen concentration was 40%.The content of IL-1beta,IL-2,IL-6,the TNF alpha of Bronchoalveolar lavage fluid and intestinal mucosa lavage fluid was compared.Results:After 5 days,compared with normal group,IL-1beta,IL-2 and IL-6 levels of both the Bronchoalveolar lavage fluid and intestinal mucosa lavage fluid dropped significantly (P<0.05),and TNF alpha of both the Bronchoalveolar lavage fluid and Intestinal mucosa lavage fluid showed a trend of decline.Conclusion:Lung and Large Intestine have the synchronicity from the perspective of mucosal immunity,and it may be the important biological basis for lung and large intestine exterior-interior relationship.

Lung and Large Intestine being interior-exteriorly related; Hyperoxia；Cytokines

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項(xiàng)目(編號：2009CB522706)

韓俊閣，女，在讀博士，研究方向：四時五臟陰陽的文獻(xiàn)整理和實(shí)驗(yàn)研究，E-mail:hanjunge@163.com

郭霞珍，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：guoxiazhen@126.com

R223.1；R2-031；R392.11

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.021