韓俊閣 劉曉燕 張劉扛 郭霞珍
(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京,100029)
“肺與大腸相表里”機(jī)理的研究
——高氧刺激對肺腸黏膜免疫因子含量表達(dá)的影響
韓俊閣 劉曉燕 張劉扛 郭霞珍
(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京,100029)
目的:通過觀察高氧下大鼠肺、腸黏膜細(xì)胞因子IL-1β,IL-2、IL-6、TNF-α含量的變化,探討“肺與大腸相表里”的生物學(xué)機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)設(shè)立正??諝饨M、高氧組(吸入40%濃度氧),比較2組肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液中IL-1β,IL-2、IL-6、TNF-α的含量。結(jié)果:造模5 d后,大鼠肺泡灌洗液和腸黏膜灌洗液中的IL-1β、IL-2、IL-6含量均較正??諝饨M呈現(xiàn)明顯下降(P<0.05);大鼠肺泡灌洗液及腸黏膜灌洗液的TNF-α也表現(xiàn)為較正??諝饨M下降的趨勢(P>0.05)。結(jié)論:肺腸之間在黏膜免疫方面具有同步性,這可能是肺與大腸表里關(guān)系的重要的生物學(xué)基礎(chǔ)。
肺與大腸相表里;高氧;細(xì)胞因子
臟腑表里相關(guān)理論是中醫(yī)學(xué)藏象學(xué)說的基本內(nèi)容,“肺合大腸”的理論基礎(chǔ)最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》,《靈樞·本輸篇》言:“肺合大腸,大腸者,傳道之府”。肺為臟屬陰,大腸為腑屬陽,二者一臟一腑,一陰一陽,互為表里,相合為用。其表里關(guān)系,首先表現(xiàn)為經(jīng)脈上,手陽明大腸經(jīng)與手太陰肺經(jīng)相互絡(luò)屬,見于《靈樞·經(jīng)脈》:“肺手太陰之脈,……下絡(luò)大腸,上膈屬肺……”;“大腸手陽明之脈,……下入缺盆絡(luò)肺,下膈屬大腸……”[1];其次,功能上,肺“主氣、司呼吸”“通調(diào)水道”,為“水之上源”,大腸為“傳導(dǎo)之官”,“主津”。肺主宣發(fā)、肅降功能正常,則津液得以布散,腸道得以濡潤,大腸傳導(dǎo)輸化糟粕功能正常,以此共同參與水液代謝、運(yùn)行氣機(jī)、傳導(dǎo)水谷等功能。生理上的相互聯(lián)系與功能配合,一旦發(fā)生異常,必會引起病理上的互相影響。目前關(guān)于肺與大腸的表里關(guān)系的研究,多從臨床病理方面進(jìn)行論述與發(fā)現(xiàn),臨床上常常見肺病及腸和腸病及肺的現(xiàn)象,但肺腸之間病理聯(lián)系的具體機(jī)制尚未明確。因此,本研究擬通過觀察高氧刺激對實(shí)驗(yàn)動物肺腸黏膜免疫因子IL-1β,IL-2、IL-6、TNF-α含量表達(dá)的影響,試從免疫學(xué)角度探討肺與大腸表里相關(guān)理論的實(shí)質(zhì)內(nèi)涵。
1.1 動物與材料
1.1.1 動物 健康雌性SD大鼠,16只,體重(200±20)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司購入。飼料由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供的普通鼠全價顆粒飼料。
1.1.2 儀器與試劑 飼養(yǎng)箱-代謝籠式可變氧飼養(yǎng)箱(自主設(shè)計);測氧儀(CW-2000QR,北京精微恒測氧技術(shù)開發(fā)中心);瓶裝氧氣與氮?dú)?北京朝紅平氣體有限公司);低溫高速離心機(jī)(美國Beckman公司);全自動洗板機(jī)(Pw-96OA,深圳匯松);酶標(biāo)儀(Rayto RT-6000)。IL-1β,IL-2、IL-6、TNF-α試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 動物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為高氧組、正??諝饨M,每組各8只。
高氧組大鼠放置于氧濃度為40%(精度±0.5%)的自制封閉氧箱飼養(yǎng),氧箱上部的接口,用來連接測氧儀,氧箱的兩側(cè)分別設(shè)有接口,一側(cè)接口連接氧氣和氮?dú)?,另一?cè)接口排氣,以保持氧箱內(nèi)外大氣壓基本一致;將大鼠提前一周入氧箱進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng),期間氧箱開啟,正常攝取食水,正式造模后,封閉氧箱,自然光照,自由攝取食水,控制氧濃度40%(精度±0.5%),濕度50%~70%,溫度22~25 ℃,每天中午定時開箱通氣1 h,添加食水,鈣石灰吸收CO2,更換墊料,連續(xù)飼養(yǎng)5 d。正??諝饨M大鼠置于正??諝鈼l件下飼養(yǎng),自然光照,濕度50%~70%,溫度22~25 ℃,自由攝取食水。
1.2.2 取材 肺泡灌洗液:將大鼠戊巴比妥鈉麻醉固定,腹主動脈取血后處死,隨即開胸,暴露氣管,用手術(shù)線結(jié)扎離心端,在其下方兩個軟骨環(huán)間作一切口,插入導(dǎo)管,導(dǎo)管與5 mL注射器連接,在支氣管分叉處用手術(shù)線結(jié)扎右側(cè)支氣管,用磷酸鹽緩沖液(PBS)4 mL進(jìn)行左肺灌洗,注射器抽吸6遍,回收液約為2~2.5 mL,將回收液在4 ℃低溫離心機(jī)上離心,3 000 r/min,離心15 min,收集上清液,-20 ℃低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>
腸黏膜粘液:將大鼠戊巴比妥鈉麻醉固定,腹主動脈取血后處死,取盲腸上部5 cm處回腸10 cm,用冷雙蒸水和PBS液依次流動沖洗后平鋪于定性濾紙上,沿回腸縱軸剪開,再用PBS液沖洗,用清潔蓋玻片輕輕刮取腸黏膜表面粘液,用凍存管收集刮取腸黏膜粘液,加入適量PBS液并小心攪拌使其充分溶解,在4 ℃低溫離心機(jī)上離心,3 000 r/min,離心15 min,收集上清液-20 ℃低溫冰箱儲存?zhèn)錂z。
1.2.3 指標(biāo)檢測 將收集的肺泡灌洗液和腸黏膜灌洗液,分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測其中IL-1β,IL-2、IL-6、TNF-α含量。
2.1 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-1β表達(dá)的比較 與正??諝饨M的測定值比較,在高氧狀態(tài)下的大鼠肺泡灌洗液和腸黏膜灌洗液的IL-1β含量表達(dá),均呈現(xiàn)明顯下降(P<0.05),兩者變化具有一致性。結(jié)果見表1。
表1 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-1β 表達(dá)的比較
注:與正??諝饨M比較,**P<0.01。
2.2 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-2表達(dá)的比較 與正??諝饨M的測定值相比較,在高氧狀態(tài)下的大鼠肺泡灌洗液和腸黏膜灌洗液的IL-2含量表達(dá),均明顯呈現(xiàn)下降(P<0.05),兩者變化具有一致性。結(jié)果見表2。
表2 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-2 表達(dá)的比較
注:與正??諝饨M比較,**P<0.01,*P<0.05。
2.3 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-6表達(dá)的比較 與正常空氣組的測定值相比較,在高氧狀態(tài)下的大鼠肺泡灌洗液的IL-6表達(dá),明顯呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05);大鼠腸黏膜灌洗液的IL-6表達(dá)也呈現(xiàn)下降趨勢,但與正??諝饨M大鼠腸黏膜灌洗液的IL-6表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。
表3 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液IL-6 表達(dá)的比較
注:與正??諝饨M比較,*P<0.05。
2.4 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液TNF-α表達(dá)的比較 與正??諝饨M的測定值相比較,在高氧狀態(tài)下的大鼠肺泡灌洗液及腸黏膜灌洗液的TNF-α表達(dá),均呈現(xiàn)出下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表4。
表4 2組大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液TNF-α 表達(dá)的比較
“肺與大腸相表里”是中醫(yī)臟腑相關(guān)理論的重要組成部分。不僅因?yàn)榻?jīng)絡(luò)上手陽明大腸經(jīng)與手太陰肺經(jīng)相互絡(luò)屬,更因?yàn)榉?、腸生理、病理上的相互聯(lián)系與影響。生理上,肺主宣發(fā)、肅降,其功能的正常發(fā)揮有助于腸道傳導(dǎo)功能的行使;大腸為“傳導(dǎo)之官”,其傳導(dǎo)功能正常反過來有利于肺氣的宣降。病理上,常??梢姷椒尾〖澳c和腸病及肺的現(xiàn)象,不但歷代典籍較多著述,如《素問·咳論》曰:“肺咳不已,則大腸受之……”;又《黃帝內(nèi)經(jīng)靈樞集注·卷五》云:“大腸為肺之腑而主大便,邪痹于大腸,故上則為氣喘爭,而下為飧瀉也。故大腸之病,亦能上逆而反遺于肺?!碧谱诤!吨形鲄R通醫(yī)經(jīng)精義·臟腑所合》論曰:“蓋邪熱不從大便而瀉,上壅于喉,宜瀉大腸,此大腸所以為傳道肺氣之府也?!盵2]在臨床上,肺病及腸、腸病及肺也是常見的病理現(xiàn)象,治療則可通過肺病治腸、腸病治肺來實(shí)現(xiàn);如哮喘發(fā)作期及COPD急性發(fā)作期的患者,多合并排便異常,或便結(jié)不通,或泄瀉下利[3-4],通過“通腑”“降瀉”“利氣”“除壅”等治法,多能達(dá)到良好治療效果;郜巒[5]通過對肺、腸相互致病的相關(guān)有效文獻(xiàn)檢索統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),在便秘、泄瀉等腸系疾病發(fā)生的患者中,咳嗽、喘促等肺系癥狀出現(xiàn)的頻率均大于20%;慢性結(jié)腸炎大腸濕熱型,通過清肺、解毒、除濕之法治療,往往收到良好療效[6];老年性便秘,從補(bǔ)肺潤肺健脾著手,則療效顯著[7];而應(yīng)用大承氣湯通腑泄?jié)嵋嗄芨纳坪粑狡染C合征實(shí)驗(yàn)動物的肺組織病變情況及提高動脈氧分壓[8]。但是,關(guān)于肺與大腸表里關(guān)系的內(nèi)在生物學(xué)機(jī)理,目前尚不明確。
體表黏膜屏障,作為抵御外來抗原的第一道防線,當(dāng)機(jī)體受到外界條件的刺激或影響時,首先出現(xiàn)相應(yīng)的改變。研究表明,呼吸道、胃腸道連同泌尿生殖道黏膜等,共同執(zhí)行局部特異性免疫功能,并通過淋巴系統(tǒng)歸巢發(fā)生聯(lián)系,構(gòu)成黏膜免疫系統(tǒng)[9]。該系統(tǒng)中黏膜局部的免疫細(xì)胞在刺激條件下合成和分泌細(xì)胞因子(CK),包括白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN)等物質(zhì),作為細(xì)胞間信號傳遞分子,主要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與免疫細(xì)胞分化發(fā)育、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與組織修復(fù)等多種功能[10]。在“肺與大腸相表里”的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),IL-1、TNF-α在肺病(哮喘)、腸病(便秘)大鼠血清中含量均顯著高于正常對照組大鼠,但肺腸合病(哮喘合并便秘)大鼠血清中其含量顯著高于單純肺病或腸病組,由此認(rèn)為IL-1、TNF-α可能是肺與大腸相關(guān)的共同物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。
組織胚胎學(xué)研究已證實(shí),肺、氣管由原腸的前腸發(fā)展而成,因此,肺、氣管與腸的結(jié)構(gòu)來源相同,可被認(rèn)為是“肺合大腸”的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[12];而我們的前期研究顯示,肺與大腸相表里在組織發(fā)生學(xué)上表現(xiàn)為肺與回腸、結(jié)腸的組織同源性[13],因此本實(shí)驗(yàn)選取肺泡灌洗液與回腸黏膜灌洗液進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在高氧(40%氧濃度)條件下,大鼠肺泡灌洗液、腸黏膜灌洗液中IL-1β、IL-2、IL-6含量的表達(dá),與正??諝饨M大鼠比較,均呈現(xiàn)明顯降低(P<0.05)。而且在高氧條件下,細(xì)胞因子TNF-α無論在大鼠肺泡灌洗液還是在腸黏膜灌洗液中含量的表達(dá),也都表現(xiàn)為較正常空氣組下降的趨勢。由此表明,肺與大腸在高氧刺激下表現(xiàn)為黏膜免疫功能的共同下降。
吳氏等在實(shí)驗(yàn)研究中也顯示[14],實(shí)驗(yàn)動物在吸入高濃度氧后,血清、肺組織及肺泡灌洗液中細(xì)胞因子的表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)的變化,表現(xiàn)為細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-6及TNF-α等出現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化趨勢,高峰時間多在24 h,而48~72 h后逐漸下降,說明細(xì)胞因子在機(jī)體急性刺激早期階段應(yīng)激性升高,而隨著高氧暴露時間延長,免疫力逐漸降低,細(xì)胞因子表達(dá)開始下降;而TNF-α為機(jī)體前炎性細(xì)胞因子,主要參與早期炎癥反應(yīng)過程,同時能促進(jìn)其他細(xì)胞因子如白介素的分泌,因此在慢性高氧刺激后期變化趨勢不明顯[15]。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同樣支持這一結(jié)果:本研究中實(shí)驗(yàn)大鼠是在40%氧濃度下飼養(yǎng)5 d,屬于慢性高氧刺激,因此其肺、腸黏膜分泌IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α的含量表現(xiàn)出了較正常空氣組均減低,其中IL-1β、IL-2、IL-6的降低更顯著。
綜上,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高氧刺激影響機(jī)體的免疫功能,慢性高氧使肺的免疫功能降低,而腸的免疫功能隨之也相應(yīng)降低。由此說明,肺腸之間在黏膜免疫方面具有同步性,這為中醫(yī)“肺與大腸相表里”的理論提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[1]張新渝,馬烈光.黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞[M].成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社,2008:100-101.
[2](清)唐宗海.中西匯通醫(yī)經(jīng)精義[M].太原:山西科學(xué)技術(shù)出版社,2013:24.
[3]易向明.哮喘發(fā)作伴大便異常的觀察及臨床意義[J].四川中醫(yī),1995,(3):7-8.
[4]張元兵,洪廣祥.“肺與大腸相表里”理論在慢性阻塞性肺疾病急性發(fā)作期的應(yīng)用[J].江西中醫(yī)藥,2000,31(3):15.
[5]郜巒.基于文獻(xiàn)分析的“肺與大腸相表里”證治規(guī)律及其關(guān)系研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2011.
[6]胡靜平.清肺愈結(jié)湯加減治療慢性結(jié)腸炎的臨床觀察[J].貴州醫(yī)藥,2008,32(2):153.
[7]周利峰.養(yǎng)肺湯治療老年人便秘85例[J].中國民間療法,2002,10(2):44.
[8]劉福成,薛芳,崔志永,等.大承氣湯治療嚴(yán)重創(chuàng)傷呼吸窘迫綜合征的實(shí)驗(yàn)與臨床研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1992,12(9):541.
[9]李國平,楊恬.粘膜免疫系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2001,17(6):594-596.
[10]龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,2000:70.
[11]惠毅,楊宇,張顯明,等.從“肺腸合病”模型大鼠血清TNF-α、IL-1含量變化探討“肺與大腸相表里”[J].遼寧中醫(yī)雜志,2012,39(1):153-154.
[12]劉文導(dǎo),向偉能,魯堯.“肺合大腸”的理論研究及臨床應(yīng)用[J].中醫(yī)研究,2005,18(8):5-6.
[13]劉聲.從上皮組織細(xì)胞變化分析肺與大腸相表里的內(nèi)涵[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2011.
[14]吳長毅,岳峰,李民,等.高濃度氧對未成年大鼠肺部炎癥反應(yīng)的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2010,22(7):389-392.
[15]易琳.新生鼠高氧肺損傷NF-κB、TNFα和IL-8表達(dá)的動態(tài)變化[D].廣州:中山大學(xué),2006.
(2014-06-20收稿 責(zé)任編輯:張文婷)
Mechanism Research on ‘Lung and Large Intestine being interior-exteriorly Related’——Effect of Hyperoxia on the Expression of CK of Lung and Intestinal Mucosa
Han Junge,Liu Xiaoyan,Zhang Liukang,Guo Xiazhen
(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,N0.11EastRoadofNorth3rdRingRoad,Beijing100029,China)
Objective:To observe the hyperoxia stimulus to lung and intestinal mucosa of rats and the changes of the content of cytokines IL-1beta,IL-2,IL-6,TNF alpha,so as to explore the biological mechanisms of ‘Lung and Large Intestine being interior-exteriorly related’.Methods:The experiment set up two groups-normal group and the hyperoxia one-which the oxygen concentration was 40%.The content of IL-1beta,IL-2,IL-6,the TNF alpha of Bronchoalveolar lavage fluid and intestinal mucosa lavage fluid was compared.Results:After 5 days,compared with normal group,IL-1beta,IL-2 and IL-6 levels of both the Bronchoalveolar lavage fluid and intestinal mucosa lavage fluid dropped significantly (P<0.05),and TNF alpha of both the Bronchoalveolar lavage fluid and Intestinal mucosa lavage fluid showed a trend of decline.Conclusion:Lung and Large Intestine have the synchronicity from the perspective of mucosal immunity,and it may be the important biological basis for lung and large intestine exterior-interior relationship.
Lung and Large Intestine being interior-exteriorly related; Hyperoxia;Cytokines
國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項(xiàng)目(編號:2009CB522706)
韓俊閣,女,在讀博士,研究方向:四時五臟陰陽的文獻(xiàn)整理和實(shí)驗(yàn)研究,E-mail:hanjunge@163.com
郭霞珍,女,教授,博士研究生導(dǎo)師,E-mail:guoxiazhen@126.com
R223.1;R2-031;R392.11
A
10.3969/j.issn.1673-7202.2015.01.021