鄭燕麗， 鄒 坤， 程 凡

(三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002)

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馬陸內(nèi)生真菌Xylariaceaesp．次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究

鄭燕麗， 鄒 坤， 程 凡*

(三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002)

研究了馬陸腸道內(nèi)生真菌Xylariaceaesp.的次級(jí)代謝產(chǎn)物.通過溶劑提取法和多種色譜方法分離單體化合物，并利用現(xiàn)代波譜技術(shù)和理化性質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定.分離并鑒定了13個(gè)化合物，分別為吩嗪-1-羧酸(1)，肉桂酸(2)， 2-n-庚基-4-羥基喹啉(3)，N-苯甲基氨基甲酸(4)，酪醇(5)， 2，3-二羥基-1-(3-吲哚基)丙酮(6)， 3，4-二羥基苯甲酸(7)，胸腺嘧啶(8)，環(huán)(甘氨酸-苯丙氨酸)(9)，環(huán)(4-羥基-脯氨酸-亮氨酸)(10)，環(huán)(4-羥基-脯氨酸-苯丙氨酸)(11)，環(huán)(甘氨酸-脯氨酸)(12)，環(huán)(甘氨酸-亮氨酸)(13).所有化合物均為首次從該屬菌種中分離得到.

馬陸； 內(nèi)生真菌； 次級(jí)代謝產(chǎn)物；Xylariaceaesp．

馬陸(Spirobolus Bungii)也稱千足蟲，是迄今發(fā)現(xiàn)的最古老陸地生物.屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)多足綱(Myriapoda)倍足亞綱(Diplopoda)動(dòng)物[1].身體有多節(jié)，長(zhǎng)筒形，有發(fā)達(dá)堅(jiān)厚的外骨骼[2].馬陸又稱馬炫，《本草綱目》中記載“馬炫處處有之，形如蚯蚓，紫黑色，其足比比至百，而皮極硬，節(jié)節(jié)有橫文如金線，首尾一般大，觸之即側(cè)臥局縮如環(huán)”、“其主治破積聚，療寒熱痞結(jié)，惡瘡等”[3].

野生炭角菌大多生于腐木或木材上，是一種分布較廣的內(nèi)生真菌[4]，某些炭角菌有很高的藥用價(jià)值[5-6].研究表明，內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的生理活性物質(zhì)[7-8].所以從馬陸腸道中分離得到的一株內(nèi)生炭角菌Xylariaceaesp.可能會(huì)有較高的藥用價(jià)值，有必要對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分研究，本實(shí)驗(yàn)從炭角菌Xylariaceaesp.發(fā)酵產(chǎn)物中共分離和鑒定了13個(gè)化合物，所有化合物均為首次從該屬菌種中分離得到.化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 化合物 1 ～ 13 的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of compounds 1 ～ 13

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV 400核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司；AmozonSL+1200液相色譜-雙重漏斗傳輸離子阱質(zhì)譜儀，德國(guó)布魯克·道爾頓公司；CBM-10A分析型高效液相色譜系統(tǒng)，LC-6AD二元梯度泵，SPD-20AV紫外檢測(cè)器，日本島津公司；低溫冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司；WZZ-2S數(shù)字式自動(dòng)旋光儀，上海精科公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA；ME215S型1/10萬電子天平，德國(guó)Sartorius公司；Cosmosil MS-II RP-C18色譜柱(5 μm，250×10 mm半制備型；5 μm，250×4.6 mm分析型)；薄層色譜硅膠GF254，青島海洋化工有限公司；正相色譜硅膠，煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所；除了分析和制備用的色譜純乙腈和色譜純甲醇外，其它試劑均為分析純.

1.2 菌株的分離、純化及鑒定

供試菌株分離自馬陸腸道，昆蟲樣品于2013年5月采集于湖北宜昌.分離前讓馬陸?zhàn)囸I24 h，于無菌條件下解剖，將馬陸置于75%酒精中表面消毒5 min，然后3%次氯酸鈉中消毒3 min，再用無菌水漂洗3次后，取出馬陸腸道加少量無菌水在無菌研缽中研磨，用無菌水對(duì)研磨液梯度稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4，分別取各梯度稀釋液0.2 mL涂布于PDA培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，待樣品周圍長(zhǎng)出菌絲，挑取單一菌落(菌體、氣生菌絲或孢子)在PDA平板上平行劃線，劃線完畢后將平板倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng).長(zhǎng)出菌絲后繼續(xù)反復(fù)多次的劃線培養(yǎng)，同時(shí)鏡檢觀察，至平板上新長(zhǎng)出的菌落的外部形態(tài)一致[9].

菌株由三峽大學(xué)涂璇副教授根據(jù)真菌形態(tài)特點(diǎn)和18S r DNA鑒定為炭角菌Xylariaceaesp.，現(xiàn)保存在三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.

1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然)；SD培養(yǎng)基(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，水1 000 mL，pH值自然)，1.25×105Pa滅菌20 min.

1.4 發(fā)酵

菌株經(jīng)PDA培養(yǎng)基斜面活化后，接種于SD種子培養(yǎng)基中，于28℃、125 r/min振蕩培養(yǎng)2 d；將培養(yǎng)好的種子液以5%的接種量接種于SD發(fā)酵培養(yǎng)基中，于搖床上28℃、125 r/min振蕩培養(yǎng)10 d，共發(fā)酵25 L.

2 提取與分離

發(fā)酵液25 L過濾、離心，再經(jīng)乙酸乙脂萃取，減壓濃縮得13.6 g粗提物.將上述粗提物合并，經(jīng)正相硅膠柱色譜(800 g正相硅膠，200～300目)分離，氯仿-甲醇(100∶0～50∶50%，V/V)梯度洗脫，得53個(gè)餾分.經(jīng)TLC及HPLC分析，合并相同組分得6個(gè)片段(Ⅰ～Ⅵ).Fr.Ⅰ部分經(jīng)甲醇重結(jié)晶，得到化合物1(27.6 mg)；Fr. Ⅱ部分經(jīng)RP-HPLC制備，以乙腈-水(68∶32，V/V)恒梯度洗脫，得化合物2(7.8 mg，Rt=7.8 min)、化合物3(17.2 mg，Rt=12.1 min)、化合物4(12.2 mg，Rt=6.5 min)、化合物12(20.3 mg，Rt=25 min)；Fr.Ⅲ部分經(jīng)RP-HPLC制備，以乙腈-水(24∶76，V/V)恒梯度洗脫，得化合物6(8.1 mg，Rt=4.7 min)、化合物7(5.8 mg，Rt=17.6 min)；Fr.Ⅳ部分經(jīng)RP-HPLC制備，以乙腈-水(15∶85，V/V)恒梯度洗脫，得化合物8(3.6 mg，Rt=6.4 min)、化合物9(7.1 mg，Rt=16.3 min)、化合物10(11.5 mg，Rt=27.5 min)、化合物11(3.9 mg，Rt=39 min)；Fr.Ⅴ部分經(jīng)RP-HPLC制備，以乙腈-水(10∶90，V/V)恒梯度洗脫，得化合物13(2.1 mg，Rt=18.7 min)、化合物5(1.9 mg，Rt=27.7 min).

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1.黃色針狀晶體(甲醇)，m.p. 238～239℃，ESI-MSm/z:225 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， CDCl3)δH:15.55(1H， br s， COOH-1)，8.98(1H， dd，J=1.2 Hz， 7.2 Hz， H-4)，8.53(1H， dd，J=1.2 Hz， 4.8 Hz， H-2)，8.33(3H， m， H-3， H-7， H-8)，8.01(2H， m， H-6， H-9)；13C NMR(100 MHz， CDCl3)δC:166.2(COOH-1)，144.2(C-10a)，143.6(C-9a)，140.3(C-5a)，140.0(C-4a)，137.6(C-3)，135.3(C-4)，133.4(C-9)，132.0(C-6)，130.5(C-2)，130.2(C-8)，128.1(C-7)，125.1(C-1).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，故鑒定化合物1為吩嗪-1-羧酸.

化合物2.無色針狀晶體(氯仿)，m.p. 131～133℃，ESI-MSm/z:149 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， CDCl3)δH:7.80(1H， d，J=16.0 Hz， H-7)，7.56(2H， dd，J=2.4 Hz， 6.0 Hz， H-2， H-6)，7.42(3H， m， H-3， H-4， H-5)，6.47(1H， d，J=16.0 Hz， H-8)；13C NMR(100 MHz， CDCl3)δC:172.4(C-9)，147.3(C-7)，134.3(C-1)，131.0(C-4)，129.2(C-3， C-5)，128.6(C-2， C-6)，117.6(C-8).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，故鑒定化合物2為肉桂酸.

化合物3.白色粉末，m.p. 364～408℃，ESI-MSm/z:244 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， CDCl3)δH:12.32(1H， br s， OH-4)，8.35(1H， t，J=7.6 Hz， H-5)，7.58(1H， t，J=6.8 Hz， H-6， H-8)，7.32(1H， t，J=7.6 Hz， H-7)，6.24(1H， br s， H-3)，2.68(2H， br s， H-1′)，1.69(4H， d，J=6.4 Hz， H-2′， H-6′)，1.23(6H， m， H-3′， H-4′， H-5′)，0.80(3H， t，J=7.2 Hz， H-7′)；13C NMR(100 MHz， CDCl3)δC:179.1(C-4)，155.5(C-2)，140.9(C-8a)，132.0(C-5)，125.5(C-6)，125.2(C-4a)，123.8(C-7)，118.8(C-8)，108.3(C-3)，34.6(C-1′)，31.8(C-5′)，29.4(C-2′)，29.3(C-3′)，29.2(C-4′)，22.8(C-6′)，14.2(C-7′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，故鑒定化合物3為2-n-庚基-4-羥基喹啉.

化合物4.黃色固體，m.p. 101～103℃，ESI-MSm/z:152 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， CDCl3)δH:10.94(1H， br s， OH-8)，9.03(1H， br s， NH-7)，7.35(5H， m， H-2， H-3， H-4， H-5， H-6)，3.71(2H， s， H-7)；13C NMR(100 MHz， CDCl3)δC:177.6(C-8)，133.7(C-1)，129.6(C-2， C-6)，128.8(C-3， C-5)，127.5(C-4)，41.3(C-7).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故鑒定化合物4為N-苯甲基氨基甲酸.

化合物5.無色油狀物，m.p. 90～92℃，ESI-MSm/z:139 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δH:9.13(1H， br s， OH-4)，6.98(2H， dd，J=2.0 Hz， 6.8 Hz， H-2， H-6)，6.65(2H， dd，J=2.0 Hz， 6.4 Hz， H-3， H-5)，4.57(1H， br s， OH-2′)，3.51(2H， t，J=6.8 Hz， H-2′)，2.59(2H， t，J=7.2 Hz， H-1′)；13C NMR(100 MHz， DMSO-d6)δC:155.5(C-4)，129.7(C-2， C-6)，129.4(C-1)，114.9(C-3， C-5)，62.6(C-2′)，38.3(C-1′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，故鑒定化合物5為酪醇.

化合物6.無色結(jié)晶(甲醇)，m.p. 200～202℃，ESI-MSm/z:206 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δH：：11.97(1H， s， NH-1)，8.42(1H， s， H-2)，8.21(1H， dd，J=1.6 Hz， 6.0 Hz， H-4)，7.48(1H， dd，J=1.2 Hz， 6.4 Hz， H-7)，7.20(2H， m， H-5， H-6)，5.11(1H， d，J=6.0 Hz， OH-10)，4.72(1H， s， OH-9)，4.68(1H， dd，J=5.2 Hz， 10.4 Hz， H-9)，3.69(1H， dd，J=6.0 Hz， 10.8 Hz， H-10a)，3.63(1H， dd，J=5.2 Hz， 10.4 Hz， H-10b)；13C NMR(100 MHz， DMSO-d6)δC:195.4(C-8)，136.2(C-7a)，134.7(C-2)，125.8(C-3a)，122.8(C-6)，121.7(C-5)，121.3(C-4)，113.9(C-3)，112.0(C-7)，75.7(C-9)，65.2(C-10).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，故鑒定化合物6為2，3-二羥基-1-(3-吲哚基)丙酮.

化合物7.白色粉末，m.p. 196～198℃，ESI-MSm/z:155 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δH:7.56(1H， s， H-2)，7.50(1H， dd，J=1.8 Hz， 8.2 Hz， H-6)，6.92(1H， d，J=8.2 Hz， H-5)；13C NMR(100 MHz， DMSO-d6)δC:166.9(COOH-1)，149.7(C-4)，144.6(C-3)，122.7(C-6)，122.2(C-1)，116.5(C-2)，114.7(C-5).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定化合物7為3，4-二羥基苯甲酸.

化合物8.白色片狀結(jié)晶(甲醇)，m.p. 315～317℃，ESI-MSm/z:127 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δH:10.99(1H， br s， HN-3)，10.62(1H， br s， HN-1)，7.25(1H， s， H-6)，1.72(3H， s， CH3-5)；13C NMR(100 MHz， DMSO-d6)δC:165.0(C-4)，151.5(C-2)，137.7(C-6)，107.6(C-5)，11.8(CH3-5).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定化合物 8 為胸腺嘧啶.

4 結(jié)論

本研究采用常規(guī)的色譜分離純化方法，對(duì)馬陸腸道內(nèi)生真菌炭角菌Xylariaceaesp.的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)分離.從其乙酸乙酯萃取物中分離并鑒定了13個(gè)化合物，包括吩嗪-1-羧酸(1)，肉桂酸(2)，2-n-庚基-4-羥基喹啉(3)，N-苯甲基氨基甲酸(4)，酪醇(5)，2，3-二羥基-1-(3-吲哚基)丙酮(6)，3，4-二羥基苯甲酸(7)，胸腺嘧啶(8)，環(huán)(甘氨酸-苯丙氨酸)(9)，環(huán)(4-羥基-脯氨酸-亮氨酸)(10)，環(huán)(4-羥基-脯氨酸-苯丙氨酸)(11)，環(huán)(甘氨酸-脯氨酸)(12)，環(huán)(甘氨酸-亮氨酸)(13).以上研究結(jié)果進(jìn)一步闡明了馬陸腸道內(nèi)生真菌炭角菌Xylariaceaesp.次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分特點(diǎn)，為其化學(xué)成分及相關(guān)生物活性的研究奠定了基礎(chǔ).

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Secondary metabolites fromXylariaceaesp. of Spirobolus Bungii endophytic fungus

ZHENG Yanli， ZOU Kun， CHENG Fan

(Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development，China Three Gorges University, Yichang， Hubei 443002)

To study secondary metabolites fromXylariaceaesp. of Spirobolus Bungii endophytic fungus, the compounds were isolated by different solvent extraction and chromatographic methods. Their structures were identified by modern spectral technology and physicochemical properties. Thirteen compounds were obtained and identified as phenazine-1-carboxylic acid (1)， cinnamic acid (2)， 2-n-heptyl-4-hydroxyquinoline (3)， N-(phenylmethy)-carbanic acid (4)， tyrosol (5)， 1-(3-indolyl)-2，3-dihydroxypropan-1-one (6)， 3，4-dihydroxy benzoic acid (7)， thymine (8)， cyclo (Gly-Phe) (9)， cyclo (4-hydroxyl-Pro-Leu) (10)， cyclo (4-hydroxyl-Pro-Phe) (11)， cyclo (Gly-Pro) (12) and cyclo (Gly-Leu) (13). All the compounds were isolated from the endophytic fungus ofXylariaceaesp. for the first time．

Spirobolus Bungii; endophytic fungus; secondary metabolites;Xylariaceaesp．

2015-02-26.

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014CFB692)；三峽大學(xué)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(KJ2014B026).

1000-1190(2015)03-0392-05

O629

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: fancy1351@163.com