DOI: 10. 3969/j.issn.1672-8521.2015.02.017

基金項(xiàng)目：國(guó)家“973”計(jì)劃資助項(xiàng)目（2012CB518105）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81121004，81230041，81171798）

通訊作者：張翠萍（E-mail:zcp666666@sohu.com）；付小兵（E-mail:fuxiaobing@vip.sina.com）

微小RNA（miRNA）是由18 ～24個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA。研究預(yù)測(cè)，人類基因組中超過60%的基因受miRNAs調(diào)節(jié), miRNAs在各種生理、病理過程和疾病治療中發(fā)揮著重要作用 [1-2]。作為分子生物領(lǐng)域一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，當(dāng)前miRNAs的研究發(fā)展迅速，獲得了重要的研究進(jìn)展，但miRNA研究仍處于早期階段，尤其面向臨床應(yīng)用時(shí)，許多現(xiàn)實(shí)問題和技術(shù)性瓶頸仍有待于解決。著名的國(guó)際制藥公司羅氏公司（Roche）取消了其RNA干擾研究項(xiàng)目，由此可看出，miRNA治療從實(shí)驗(yàn)室到臨床的道路上還有許多現(xiàn)實(shí)困難有待突破。本文主要綜述miRNA治療在臨床應(yīng)用時(shí)遇到的現(xiàn)實(shí)困難，可能是今后miRNA研究需突破的主要方向。

1　miRNA成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)

與雙鏈小干擾RNA（siRNA）相比，miRNA是內(nèi)源性的，而siRNA是直接合成或通過Dicer酶由雙鏈RNA分解而成。miRNAs通過與靶基因信使RNA（mRNA）非完全配對(duì)（部分互補(bǔ)），抑制多個(gè)靶基因mRNA的翻譯，從而同時(shí)減少多個(gè)靶基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物；而siRNAs只與序列與其高度互補(bǔ)的靶基因mRNA進(jìn)行配對(duì)，導(dǎo)致特異性靶mRNA的裂解或降解。因此，siRNAs具有高效和靶點(diǎn)特異性高的特征；而miRNAs表現(xiàn)出溫和而廣泛（同時(shí)作用于多個(gè)靶點(diǎn)）的抑制效應(yīng)，這可能與疾病發(fā)生過程中眾多生物分子的復(fù)雜改變有關(guān)。

1993年，Ambros和Ruvkun首次發(fā)現(xiàn)由lin-4基因轉(zhuǎn)錄的非編碼小RNA能反向調(diào)節(jié)LIN-14蛋白的表達(dá) [3-4]。隨后miRNAs作為疾病特異性的分子標(biāo)志和治療靶點(diǎn)逐漸被揭示。在生理研究方面，miRNAs調(diào)控細(xì)胞自我更新和分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、生物發(fā)育、衰老等過程的復(fù)雜分子機(jī)制正被闡明 [5-6]；在臨床診斷方面，疾病特異性miRNAs可由miRNA芯片檢測(cè)、RNA 印跡法（northern blotting）以及實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）等手段檢測(cè)，顯著變化的疾病特異性miRNAs可作為疾病診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的生物檢測(cè)標(biāo)志。在疾病治療方面，隨著miRNAs在癌癥、病毒感染、免疫疾病和心血管疾病過程中的治療作用和調(diào)節(jié)機(jī)制的揭示，miRNAs作為一類新的治療因子，已成為當(dāng)今最具價(jià)值和潛力的藥物作用新靶點(diǎn)之一。例如，化學(xué)合成的miRNA(miR)-145通過靶向胰島素受體底物-1在體外成功地抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng) [7]；miR-451模擬物作為腫瘤抑制劑，減弱了人膠質(zhì)瘤的擴(kuò)散能力，加速了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡 [8]。雖然miRNAs用于臨床治療有著美好的前景，但現(xiàn)階段的相關(guān)研究中還有很多問題需要解決。

2　miRNA在實(shí)驗(yàn)室研究中存在的問題

2.1　miRNA制備過程中數(shù)量和質(zhì)量的不穩(wěn)定性　目前，提取RNA的方法主要為Trizol/TRI試劑法和硅/玻璃纖維過濾法。其中，Trizol/TRI試劑提取法最常用。在miRNA制備和儲(chǔ)存過程中，miRNA的不穩(wěn)定性導(dǎo)致基于miRNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性難以保證，直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)性。有研究證實(shí)，RNA樣品中的miRNA和cDNA衍生物具有高度不穩(wěn)定性，在–80 ℃保存幾天后逐漸降解 [9]。相同部位的組織，采樣方法不同，組織保存方法不同，所提取的RNA質(zhì)量也完全不同 [10]。為了使RNA提取盡量標(biāo)準(zhǔn)化，必須做到：采用Trizol/TRI試劑提取，避免基因組DNA的污染；確保提取過程中無RNA酶污染（包括使用無酶的液體、容器、槍頭、手套等），避免miRNA降解。

2.2　辨別miRNA靶點(diǎn)和驗(yàn)證miRNA生物功能的復(fù)雜性

miRNA的靶點(diǎn)驗(yàn)證和生物功能學(xué)識(shí)別是miRNA在實(shí)驗(yàn)室研究中的限速步驟。某種疾病表型的miRNA表達(dá)譜的改變，以及與之相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄子和蛋白的變化，可分別通過miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)、全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析和蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析來確定。然而，這些檢測(cè)手段有其局限性。通常miRNA芯片能檢測(cè)出幾十至幾百個(gè)差異顯著的miRNAs,而每個(gè)miRNA可預(yù)測(cè)出成百上千個(gè)可能作用的靶基因，這使得miRNA下游靶點(diǎn)和功能的驗(yàn)證任務(wù)巨大，系統(tǒng)驗(yàn)證難以實(shí)現(xiàn) [11]。靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件如miRanda、TargetScan、PicTar等均是基于Watson-Crick堿基配對(duì)原理進(jìn)行序列匹配，因此預(yù)測(cè)結(jié)果只具有序列特異性，并不具有基因特異性，不能說明其具有實(shí)際的基因功能。并且，生物信息學(xué)輔助的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，只能預(yù)測(cè)出全mRNA表達(dá)譜檢測(cè)到的顯著差異靶點(diǎn)中的50%，因而丟失了部分真陽性的功能性靶點(diǎn)，包含了部分假陽性的非功能性靶點(diǎn)。

其次，評(píng)價(jià)特定表型的組織器官中miRNA發(fā)揮的生物功能是更為復(fù)雜的事情。每個(gè)特定功能都由一系列分子的調(diào)節(jié)決定，而每個(gè)分子的表達(dá)受多個(gè)miRNA的調(diào)節(jié)，并且除miRNA調(diào)節(jié)外，還受基因突變修飾、甲基化 [12]等其他轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，即使是同一miRNA進(jìn)行干預(yù)，體內(nèi)和體外miRNA表達(dá)譜的變化也不一樣，這些使得miRNA生物功能的研究十分困難。

3　miRNA治療在臨床應(yīng)用中面臨的新挑戰(zhàn)

3.1　miRNA制劑的傳遞和傳遞載體　實(shí)現(xiàn)miRNA治療的前提條件是安全有效地傳遞miRNA制劑。miRNA傳遞必須通過系列天然的生理屏障。首先，需避免免疫細(xì)胞吞噬、內(nèi)切核酸酶降解、血清蛋白結(jié)合和腎臟過濾（過濾分子質(zhì)量<50 kDa的粒子），穿過血液循環(huán)到達(dá)靶組織血液中；其次，它們必須通過血管內(nèi)皮外溢至靶組織（>5 nm的粒子不能穿過血管內(nèi)皮）；最后，它們必須穿過細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞，通過胞內(nèi)體最終釋放至胞漿 [13-14]。

目前，miRNA傳遞系統(tǒng)主要包括化學(xué)合成的單鏈miRNA 抑制劑和雙鏈miRNA 模擬物、miRNA“海綿”和“誘餌”（多個(gè)miRNA的串聯(lián)）、脂質(zhì)體、納米粒傳遞和miRNA病毒載體傳遞 [15]。

化學(xué)合成的miRNA 抑制劑和模擬物,成本低，特異性好，但是由于它具有強(qiáng)親水性、帶負(fù)電荷等一系列理化特性，使得穿透細(xì)胞膜的能力差，因而吸收率低；并且由于體內(nèi)內(nèi)源性核酸酶的降解和腎臟的瞬間清除，體內(nèi)濃度不穩(wěn)定，血漿半衰期短，使用時(shí)所需劑量較大，使得臨床應(yīng)用受到限制。

脂質(zhì)體和納米粒傳遞是最有臨床應(yīng)用潛力的兩種miRNA傳遞載體。通過脂質(zhì)體和細(xì)胞膜的融合，脂質(zhì)體包裹的miRNA能有效地釋放進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)脂質(zhì)體的包裹可保護(hù)寡核苷酸免受內(nèi)源性核酸酶的降解，提高其穩(wěn)定性。然而，據(jù)報(bào)道陽離子脂質(zhì)體具有高度免疫原性，能引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。直徑50～70 nm的納米粒傳遞系統(tǒng)，例如聚乙二醇（PEG）包裹的陽離子脂雙層、聚乙烯亞胺（PEI）-miRNA復(fù)合物、端膠原-miRNA復(fù)合物、多乳酸共交酯（PLGA）納米粒，能顯著降低miRNA制劑的免疫原性，提高生物兼容性，同時(shí)增強(qiáng)miRNA穩(wěn)定性，避免降解，甚至達(dá)到緩釋、控釋的效果 [16-18]。同時(shí)，納米粒傳遞系統(tǒng)還為疾病的靶向治療提供了可能。研究表明，腫瘤靶向性單鏈Fv片段（scFv）修飾的納米粒傳遞系統(tǒng)，能使siRNAs和miR-34a直接靶向肺癌細(xì)胞 [19]；攜帶磁芯的納米粒傳遞后，通過磁力操控可實(shí)現(xiàn)特定部位靶向治療 [20]。然而，納米粒傳遞系統(tǒng)的最大弊端是其用藥后藥物在體內(nèi)停留短暫，隨后被肝臟、腎臟快速清除，這使得臨床應(yīng)用時(shí)需反復(fù)給藥，才能達(dá)到治療效果。

miRNA表達(dá)的病毒載體包括慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒，也是一類重要的傳遞載體。這些裝載miRNA基因表達(dá)盒子的病毒載體一旦轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，能長(zhǎng)期地、持續(xù)穩(wěn)定地高表達(dá)miRNA。但是使用病毒載體最大的問題是安全問題。病毒DNA整合入宿主基因組，導(dǎo)致病毒基因隨機(jī)插入，可能使正?；虬l(fā)生紊亂，激活有害基因，尤其是癌癥基因，導(dǎo)致癌變或插入性基因突變。另外，利用病毒載體傳遞，很難實(shí)現(xiàn)精確靶向某些組織或細(xì)胞，容易出現(xiàn)非特異性不良反應(yīng)。同時(shí)，腺病毒和腺相關(guān)病毒載體的轉(zhuǎn)染也容易激活宿主的免疫反應(yīng)。

3.2　miRNA調(diào)節(jié)藥物的特異性和失靶作用　失靶作用的首次提出是在2003年，是指干擾性RNA作用于預(yù)期干擾的目標(biāo)靶分子之外的其他細(xì)胞分子而產(chǎn)生的基因干擾行為 [21]。失靶作用的發(fā)生機(jī)制是miRNA 5′端的種子區(qū)域（核苷酸位置2–7或2–8）的反義鏈與其靶mRNA的3′非翻譯區(qū)序列的完全匹配，種子區(qū)域的互補(bǔ)也是miRNA能作用于多個(gè)靶點(diǎn)的本質(zhì)原因 [22]。多靶點(diǎn)的意義在于，miRNAs可同時(shí)靶向?qū)е履骋患膊〉亩鄠€(gè)靶基因或一個(gè)基因家族的多個(gè)成員，類似設(shè)計(jì)如人工多靶點(diǎn)miRNA（SMART）。然而，多靶點(diǎn)也可能導(dǎo)致廣泛性失靶，帶來非預(yù)期的不良反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-208a調(diào)節(jié)橫紋肌細(xì)胞肌球蛋白開關(guān)的同時(shí)，也能調(diào)節(jié)全身能量代謝和高脂飲食引起的肥胖 [23]。MiR-9、miR-15a、miR-27等9個(gè)miRNAs，既參與調(diào)節(jié)肥胖和糖尿病患者的葡萄糖和脂肪代謝，也參與癌癥細(xì)胞的增殖、遷移和耐藥 [24]。MiR-29模擬物是一種有潛力的抗癌藥物，能靶向多個(gè)癌癥相關(guān)的信號(hào)通路，但過表達(dá)miR-29將導(dǎo)致自身免疫疾病和骨髓過度增殖 [25-26]。靜脈輸注膽固醇結(jié)合的miR-10b阻斷劑，能成功抑制小鼠乳房腫瘤的轉(zhuǎn)移，但同時(shí)也改變了肝、脾的尺寸和血漿蛋白成分 [27]。

3.3　miRNA介導(dǎo)的藥物或化合物的毒性　有關(guān)miRNA介導(dǎo)的毒性的報(bào)道中，最突出的一個(gè)研究是細(xì)胞短發(fā)夾RNAs （shRNAs）過飽和地結(jié)合sh/miRNA通路中的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5，競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性miRNA的加工合成，從而導(dǎo)致小鼠的肝毒性，加大小鼠死亡率 [28]。Let-7c是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要miRNA，研究表明過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）激動(dòng)劑通過抑制let-7c可導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖 [29]。藥物或化合物等外源性物質(zhì)的解毒主要靠肝臟中的代謝酶，例如細(xì)胞色素P450s（CYPs）。研究表明，miRNAs可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)CYPs表達(dá)，miR-27b、miR-126、miR-378和miR-125b分別在轉(zhuǎn)錄后水平抑制CYP1B1與CYP3A4、CYP2A3、CYP2E1和CYP24A1的表達(dá)。CYPs表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)受控于核受體，而孕烷X受體、維生素D受體（VDR）、人核因子4a（HNF4α）和人芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)也分別受miR-148a、miR-125b與miR-27b（VDR）、miR-24與miR-34a （HNF4α）和miR-24的調(diào)控 [30]。特異性miRNAs低調(diào)CYPs代謝酶的表達(dá)后，將導(dǎo)致機(jī)體對(duì)藥物或外來化合物的代謝能力減弱，使化合物在體內(nèi)蓄積導(dǎo)致毒性。

3.4　miRNA治療藥物的劑量考慮　有研究表明，氣管內(nèi)給予大劑量合成的CpG寡脫氧核苷酸將導(dǎo)致急性肺損傷，并激活全身免疫反應(yīng) [31]；不同劑量的miR-24阻斷劑選擇性沉默不同組織細(xì)胞中的miR-24 [32]。但目前大部分有關(guān)miRNA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，為了得到所期望的陽性結(jié)果，一味地加大劑量，且僅驗(yàn)證目標(biāo)組織器官所期望的生物效應(yīng)，而其他組織器官以及目標(biāo)組織器官的其他效應(yīng)不予觀察，這種劑量數(shù)據(jù)顯然不切實(shí)際，臨床應(yīng)用時(shí)需重新設(shè)計(jì)。對(duì)于基于miRNA的治療藥物，存在飽和藥物濃度的問題，即體內(nèi)達(dá)到該藥物濃度時(shí)，有限的靶mRNA被全部促進(jìn)或抑制，超過這個(gè)濃度，藥效不會(huì)增加，而不良反應(yīng)反而加大。為了減小失靶和不良反應(yīng)，可通過量-效關(guān)系實(shí)驗(yàn)確定藥物的最低有效劑量。另外，通過制劑的修飾和改進(jìn)，也可以降低有效劑量。研究表明給予LNA修飾的miR-122的寡核苷酸抑制劑只需1～25 mg/kg，便能起到相當(dāng)于給予膽固醇修飾的miR-122抑制劑120～240 mg/kg對(duì)醛縮酶A的上調(diào)作用 [33]。

4　展望

盡管miRNA在臨床病理、診斷和治療方面的應(yīng)用還處于起步階段，miRNA治療離安全有效地臨床應(yīng)用還有很大距離，但越來越多miRNA干預(yù)的成功應(yīng)用已經(jīng)在基礎(chǔ)研究中被證實(shí)，有的已嘗試進(jìn)行藥物的臨床試驗(yàn)。迄今為止，研究最成熟的miRNA制劑是LAN修飾的miR-122拮抗劑靶向治療丙型肝炎(HCV)，其機(jī)制是抑制HCV病毒RNA的復(fù)制。Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，LAN修飾的miR-122拮抗劑治療HCV具有良好的應(yīng)用前景?？焖侔l(fā)展的miRNA治療將為人類疾病的基因治療提供新的機(jī)遇，miRNA作為一類頗具潛力的藥物作用新靶點(diǎn)，將更廣泛地應(yīng)用于人類疾病治療領(lǐng)域。