劉超 景贊

（樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川樂山 614000）

飼料中黃曲霉毒素B1的檢測

劉超 景贊

（樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，四川樂山 614000）

采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)飼料中黃曲霉毒素B1進(jìn)行檢測。建立了以Inertsil ODS-3為液相色譜柱，以0.1%甲酸水、乙腈（0.1%甲酸）為流動(dòng)相，質(zhì)譜使用電噴霧離子源，正離子掃描，以313.0/285.0為定量離子對(duì)的LC-MS/MS檢測方法。結(jié)果表明：該方法所測得的黃曲霉毒素B1在0～100.0ng/mL內(nèi)具有良好線性，檢出限為2.8μg/kg，加標(biāo)回收率在93.3%～98.3%。該方法適合飼料中黃曲霉毒素B1的分析檢測。與傳統(tǒng)的薄層色譜、高效液相色譜法相比較，該方法具有分析速度快、操作方便、重現(xiàn)性好、靈敏度高等特點(diǎn)。

飼料；黃曲霉毒素B1；液質(zhì)聯(lián)用

黃曲霉毒素B1（AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)苌铮幸粋€(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?，是已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種。AFB1污染的物質(zhì)包括食品中的花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等農(nóng)產(chǎn)品及其加工產(chǎn)品；且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴(yán)重。黃曲霉毒素?zé)o臭、無味、無色，在飼料中及其穩(wěn)定，對(duì)家禽、家畜的健康威脅極大，作為飼料強(qiáng)制性衛(wèi)生監(jiān)控指標(biāo)，目前有半定量薄層色譜法[1]、免疫親和柱凈化——高效液相色譜法[2]、免疫親和熒光光度法[3]、酶聯(lián)免疫吸附法[4]。高效液相色譜法雖然靈敏度高，但是樣品前處理繁瑣，操作復(fù)雜；薄層色譜法雖然簡便，但是靈敏度差，因此研究能夠準(zhǔn)確、快速檢測飼料中AFB1的檢測方法是十分必要且具有現(xiàn)實(shí)意義的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

甲酸，優(yōu)級(jí)純；

乙腈，色譜純；

超純水；

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（2μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研所）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，DGU-20A-API3200；

分析天平（精確度0.01mg，）德國賽多利斯集團(tuán)，CP225D；

自動(dòng)旋渦混合器，天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠，ZH-2；

水浴恒溫振蕩器，常州冠軍儀器制造有限公司，SHA-B。

1.3 AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

根據(jù)需要將AFB1用50%甲醇水稀釋成濃度為0、10、20、40、80、100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.4 試樣的提取

準(zhǔn)確稱取研碎混勻的試樣5.00g，置于100mL具塞三角瓶中，加入25mL50%甲醇水，置于自動(dòng)渦旋混合器中渦旋1min，水浴恒溫振蕩器中振蕩10min，于4000r/min離心5min，吸取10mL上清液于50mL分液漏斗中，加入10mL三氯甲烷，加蓋輕輕振搖3min，靜置分層，棄去三氯甲烷層，再加入10mL三氯甲烷重復(fù)上述步驟，過0.22μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 色譜條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3，4.6×150mm，5μm；

進(jìn)樣體積：10μL；

流速：0.3mL/min；

柱溫：40℃；

流動(dòng)相：A-0.1%甲酸水B-0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫Table 1Mobile phase condition

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測MRM；霧化氣、氣簾氣、輔助加熱器、碰撞氣均為高純氮?dú)猓籌S：5000V；GS1：30Psi；CUR：10Psi；GS2：40Psi；TEM：450℃；CAD：3mL/min。

表2 定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓Table 2Qualitative ion pair,quantitative ion pair,collision gas energy,cluster voltage

2 結(jié)果討論

2.1 液相色譜柱的選擇

Inertsil ODS-3代表了當(dāng)今世界上新一代C18反相填料，從硅脫離危險(xiǎn)原料的選擇到鍵合工藝及最終包譜柱的裝填，各著工序都經(jīng)過嚴(yán)格的考察、設(shè)計(jì)。Inertsil ODS-3色譜柱主要特點(diǎn)：高純度球形硅膠，高度統(tǒng)一的粒徑分布，高超的化學(xué)鍵合技術(shù)，端基封尾處理技術(shù)，因此本試驗(yàn)中使用Inertsil ODS-3（4.6×150mm，5μm）作為分析柱。并取得良好效果。

2.2 流動(dòng)相的選擇

本文考察了GB/T30955-2014[2]中流動(dòng)相為甲醇+水（45+55），和0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈作為流動(dòng)相，從峰型、峰寬、靈敏度等方面考慮，最終選擇0.1%甲酸水（A）、0.1%甲酸乙腈（B）做為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。可能的原因是AFB1在正離子模式下掃描，而甲酸在正離子模式下有增強(qiáng)信號(hào)作用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍

以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品AFB1溶液濃度為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.4 方法檢出限

由自動(dòng)進(jìn)樣器吸取1ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10μL，注入色譜儀中，平行進(jìn)樣3次，求出儀器檢出限的平均值，而后求出方法檢出限。結(jié)果見表3。

圖1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Fig.1Standard curve regression equation of AFB1

表3 AFB1檢出限Table 3Detection limit of AFB1

由表3可知儀器平均檢出限為0.00534ng，方法檢出限為2.8μg/kg，可見，儀器和方法靈敏度很高，能滿足日常檢驗(yàn)要求。

2.5 加標(biāo)回收率

表4 AFB1加標(biāo)回收率Table 4Adding standard recovery of AFB1

將AFB1儲(chǔ)備液稀釋至5μg/mL，準(zhǔn)確稱取9份研碎混勻的試樣各5.00g，置于100mL具塞三角瓶中，加入25mL50%甲醇水，分別準(zhǔn)確移取0.01mL、0.05mL、0.1mL上述AFB1溶液各三份至9份試樣中，其他步驟同1.3，計(jì)算加標(biāo)回收率。

由表4可知，該方法回收率為93.3%～98.3%。符合GB/T27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測中的規(guī)定（80%～110%）。

2.6 重復(fù)性

準(zhǔn)確稱取6份研磨均勻的空白試樣5.00g置于100mL具塞三角瓶中，分別準(zhǔn)確移取1.00mL濃度為125ng/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)容液，其他步驟同1.3，記錄色譜圖，測定峰面積。計(jì)算出RSD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSD為0.30%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

3 實(shí)際樣品分析

用建立的方法對(duì)市場上的飼料進(jìn)行測定，結(jié)果表明：AFB1在大多數(shù)飼料中未檢出?？赡艿脑蚴窍奶鞙囟冗^高，不適宜黃曲霉的繁殖與生長，也可能是這些飼料濕度均為10%以下，不適宜黃曲霉的繁殖與生長。

4 結(jié)論

建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測飼料中的AFB1殘留方法，此方法檢出限為2.8μg/kg，線性范圍0～100.0ng/mL，回收率為93.3%～98.3%，精密度為0.30%。所建方法能夠滿足實(shí)際檢測的需要。

[1]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 8381-2008飼料中黃曲霉毒素B1的測定半定量薄層色譜法[S].北京：中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,2008.

[2]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 30955-2014飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法[S].北京:中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,2014.

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T 2549-2014飼料中黃曲霉毒素B1的測定免疫親和柱熒光光度法[S].北京:中華人民共和國農(nóng)業(yè)部,2014.

[4]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 17480-2008飼料中黃曲霉毒素B1的測定酶聯(lián)免疫吸附法[S].北京:中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,2008.

Detection of AFB1 in Feed

LIU ChaoJING Zan
(Leshan Food and Drug Inspection and Testing Center,LeShan 614000,China)

We tested aflatoxin B1 in feed with LC-MS/MS method.A method was developed with novel HPLC column Inertsil ODS-3,Mobile phase was 0.1%methanoic acidwater,0.1%methanoic acid acetonitrile,combined with MS, which used positive ion scanning,and quantification ion pair was 313.0/285.0.A good linear in 0～100.0ng/mL.detection limit was 2.8μg/kg.Adding standard recovery was 93.3%～98.3%.This method has advantages of being fast,easy, reproducible and relatively sensitive compared with TLC and HPLC.

Feed;AFB1;LC-MS/MS

book=25,ebook=31

TS207

A

1008-1038(2015)12-0025-03

2015-06-26

劉超（1984—），男，助理工程師，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>