劉平平 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

禽流感(AI)是A型流感病毒(AIV)引起的禽類全身性或呼吸器官性傳染病，主要侵害雞、火雞、鴨和鵝等。我國《家畜家禽防疫條例》和國際獸疫局動物流行病組織(OIE)規(guī)定該病為A類烈性傳染病。該病的毒型眾多、變異性極強、低致病性毒株能在短期內變成高致病性毒株(HPAIV)，從而給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性打擊。根據禽流感病毒血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)抗原性的變異情況，可以把它區(qū)分成很多亞型，目前已分離鑒定的AIV分為16個H亞型和10個N亞型。絕大部分禽流感病毒是無毒或低毒的，禽類感染后不表現任何臨床癥狀，只有少數毒株才引起臨床癥狀，甚至發(fā)生嚴重死亡。進入80年代以來，引起高致病力禽流感流行的主要為H5和H7亞型。高致病性禽流感的暴發(fā)和流行，常常給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性的經濟損失。本文用AIV－H7N3進行致病力檢測并制成油乳劑甲醛滅活疫苗，再用此疫苗和實驗室提供的H5N1、H9N2油乳劑甲醛滅活疫苗對雞只進行免疫，并用AIV－H5、AIV－H7、AIV－H9進行交叉攻毒，檢測油乳劑滅活苗針對自身病毒攻擊的免疫效力和針對HA亞型不同的AIV抗原的交叉保護力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 非免疫雞胚 7日齡非免疫雞胚孵化至9～11日齡。

1.1.2 雞 1日齡石岐雜黃雞在動物試驗室隔離飼養(yǎng)至28日齡，期間不做任何免疫。

1.1.3 毒株、疫苗 AIV－H7毒株、H5N1、H9N2甲醛滅活油乳劑疫苗。

1.1.4 抗原與抗體 AIV－H5、AIV－H7、AIV－H9標準抗原和抗體。

1.1.5 主要試劑 10號白油、司本-80、吐溫-80、甲醛溶液、硬脂酸鋁、瓊脂糖、高速組織搗碎機、0.85%生理鹽水、青霉素、鏈霉素。

1.1.6 主要儀器及設備 AllegraTm64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機、高速攪拌器Ultra-turrax、mICRO-mIXER振蕩器、臺式低速離心機TGL-16G。

1.1.7 其他試驗材料 1ml 注射器(1 次性)若干，finnpipette digitaL10～50、50ul/200～1000ul各一只，96孔V型微量反應板，標記筆，過濾器(1次性)，西林瓶若干，打孔器，酒精燈，剪刀，鑷子，棉拭子。

1.2 方法

1.2.1 雞胚平均死亡時間(mDT)的測定 參照郭玉璞(1994)的方法稍加改進。將無菌的含AIV－H7N3尿囊液用滅菌生理鹽水做倍比稀釋(10-2～10-9)，每一稀釋度經尿囊腔途徑接種5枚非免疫雞胚，0.2ml/胚，同時設生理鹽水對照，35℃培養(yǎng)7d。照胚2次/d，記錄死亡胚數及其死亡時間，收獲尿囊液測定HA效價。使所有雞胚死亡的最高稀釋倍數為病毒的最小致死劑量，mDT的計算公式：

根據最小致死量的雞胚平均死亡時間的指標測定，雞胚平均死亡時間(mDT)，弱毒為90h以上，中毒為60～ 90h，強毒為40～60h。

1.2.2 甲醛滅活油乳劑疫苗的制備和檢測 （1）疫苗的種毒滅活：將增殖后的病毒接種普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱營養(yǎng)瓊脂無菌檢驗合格后，測定其HA效價，選擇HA效價≥29抗原用0.1%的甲醛溶液37℃作用48h滅活，并用滅活的絨毛尿囊液接種敏感雞胚檢驗滅活效果。4℃下保存?zhèn)溆?。?）甲醛滅活油乳劑疫苗的配制方法：按照羅開健(1999)的方法配制。水相配制：將滅菌吐溫-80按3%(V/V)加入滅活抗原內，攪拌混合均勻。油相配制：10號白礦油、司本-80、硬脂酸鋁按94:6:2比例通過加勢攪拌溶化后，121℃高壓滅菌20min，置室溫保存?zhèn)溆?。疫苗配制：將水相與油相按2:3比例，先將油相傾入膠體磨中攪拌，再緩慢加入水相，加完后循環(huán)攪拌4min，使混合物充分乳化，即為乳白色的油乳劑滅活疫苗。共制備3批疫苗。（3）甲醛滅活油乳劑疫苗質量的檢測：疫苗的無菌檢測：將配制的疫苗接種普通培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃溫育96h，觀察有無細菌生長。疫苗的外觀檢測：肉眼觀察上述滅活疫苗的外觀。疫苗的穩(wěn)定性檢測：取一部分疫苗置離心管中，3500r/min離心15min，觀察疫苗有無分層及破乳的情況出現，并放室溫繼續(xù)觀察。疫苗劑型檢測：將以上油乳劑疫苗分別滴于冷水表面，疫苗不分散為油包水型，分散則為水包油型。疫苗的粘度檢測：在室溫25℃下用1ml吸管(下口內徑1.2mm，上口內徑2.7 mm)吸取疫苗1ml，使其垂直流出0.4ml的時間應不超過8s。疫苗的安全性檢測：取5、15、28d齡石岐雜黃雞各8只，按疫苗常規(guī)免疫劑量(5～15d齡：0.3ml/只、28d齡：0.5ml/只)的4倍即各1.2ml/只、2ml/只，在左右兩邊肩部肌肉注射試驗雞，觀察2w，并剖殺試驗雞檢查注射部位有無異常。

1.2.3 流感各亞型之間的交叉保護試驗 將96只28d齡的雞隨機分成12組，每組8只；I、II、III組用H5N1油苗以0.5ml/只劑量進行免疫，免后3w分別以102LD50×0.2ml的H5、105EID50×0.5ml的H7、105EID50×0.2ml的H9進行肌注攻毒；IV、V、VI組用H7N3油苗以 0.5ml/只劑量進行免疫，免后3w分別以102LD50×0.2ml的H5、105EID50×0.5ml的H7、105EID50×0.2ml的H9進行肌注攻毒；VII、VIII、IX組用H9N2油苗以0.5ml/只劑量進行免疫，免后3w分別以102LD50×0.2ml 的H5、105EID50×0.5ml 的H7、105EID50× 0.2ml的H9進行肌注攻毒；X、XI、XII組用陰性尿囊液制成的油苗以0.5ml/只劑量進行免疫，免后3w 分別以102LD50×0.2ml的H5、105EID50×0.5ml的H7、105EID50×0.2 ml的H9進行肌注攻毒；同時設空白對照組8只。攻毒后觀察10d，同時在攻毒后3d采集攻以H7、H9各組的拭子并分離病毒，觀察疫苗的免疫保護效果。

2 結果

2.1 雞胚平均死亡時間(mDT)

經測定，AIV－H7N3毒株的雞胚平均死亡時間(mDT)為138h，根據最小致死量的雞胚平均死亡時間的指標測定，證明AIV－H7N3毒株為弱毒株。

2.2 甲醛滅活油乳劑疫苗

疫苗的種毒滅活效果：滅活的絨毛尿囊液接種敏感雞胚檢驗滅活效果為病毒已完全滅活。甲醛滅活油乳劑疫苗質量的檢測結果：疫苗乳化效果良好，無分層、破乳現象，疫苗為油包水型，垂直流出0.4ml的時間沒有超過8s，結果證明該疫苗是穩(wěn)定的。甲醛滅活油乳劑疫苗安全性檢測結果：疫苗以不同劑量接種不同日齡的雞只均未出現不良反應，精神狀態(tài)良好，食欲正常，接種部位無腫脹發(fā)熱等不良反應，剖殺這些免疫雞，注射部位也無異常反應，說明這些油乳劑疫苗對試驗雞是安全的。

2.3 流感各亞型之間的交叉保護

表1 流感各亞型之間的交叉保護試驗結果

續(xù)表1

3 討論

（1）本試驗以司本-80為油相的乳化劑，硬脂酸鋁為穩(wěn)定劑，以吐溫-80作為水相的乳化劑，水相與油相的比例為2:3，所研制的疫苗的物理性狀及免疫效力均較為理想。（2）流感各亞型之間的交叉保護試驗結果表明，用AI毒株所制油苗用同亞型AIV攻擊均獲完全保護，進一步證明了用甲醛作滅活劑制備的油乳劑滅活疫苗對同亞型AIV的感染有較強的保護作用，這為油乳劑滅活疫苗應用在生產實踐中提供了良好的試驗基礎。而用不同亞型AIV攻擊其交叉保護力，H5N1滅活疫苗在免疫后3w時對AIV－H7、AIV－H9攻擊為2/8保護，H7N3免對AIV－H9攻擊為2/8保護，H9N2免對AIV－H5攻擊則為0/8保護，表明HA亞型不同的AIV抗原之間的交叉保護力是比較低的，其中對強毒H5N1的保護作用幾乎為0。AIV亞型多且易產生變異，不同的HA亞型間缺乏良好的交叉保護性，因此單價AIV滅活疫苗在生產中的使用受到了一定的限制，現滅活苗可選用當地流行株或國際準株制成多價苗，而且亞型抗原之間不產生免疫干擾。所以，用AIV油乳劑滅活苗控制禽流感是切實可行的，必將給養(yǎng)禽業(yè)帶來明顯的經濟效益。由于試驗雞只數量所限，本試驗所進行的流感各亞型之間的交叉保護試驗，如果將試驗雞只數量增多，可能會有其他收獲，有待進一步研究