栗志民，錢(qián)佳慧，勞翠英，劉志剛

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝免疫相關(guān)酶的聯(lián)合效應(yīng)

栗志民，錢(qián)佳慧，勞翠英，劉志剛*

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

為研究溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝免疫相關(guān)酶活力的聯(lián)合效應(yīng)，采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)(CCD)和響應(yīng)曲面分析法(RSM)進(jìn)行試驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了溫度(19～31 ℃)，鹽度(22～38)對(duì)華貴櫛孔扇貝酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、谷胱甘肽還原酶(GR) 三種免疫相關(guān)酶活性的聯(lián)合效應(yīng)，旨在考察溫度與鹽度對(duì)ACP，AKP和GR活性的影響及華貴櫛孔扇貝免疫水平較高時(shí)的最佳溫度和鹽度組合，為華貴櫛孔扇貝人工養(yǎng)殖所需條件提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明：溫度的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)ACP，AKP和GR活力影響顯著(P<0.05)；鹽度的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)ACP，AKP和GR的活力影響顯著(P<0.05)；溫度和鹽度的交互作用對(duì)ACP，AKP和GR活力的影響顯著(P<0.05)。采用響應(yīng)曲面法，建立了溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP，AKP和GR活性影響的模型方程，該模型方程決定系數(shù)分別為0.986 6，0.981 3和0.957 6(P<0.01)，預(yù)測(cè)系數(shù)分別為0.934 5，0.888 0和0.738 4，表明該模型可以用于預(yù)測(cè)華貴櫛孔扇貝ACP，AKP和GR活力變化。通過(guò)模型優(yōu)化和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到在溫度24.30 ℃、鹽度30.55時(shí)，ACP和AKP活力達(dá)到最小值，分別為170.43，181.74 U/mg，而GR活力最大為0.34 U/mg，滿(mǎn)意度達(dá)0.95。

華貴櫛孔扇貝；響應(yīng)曲面；堿性磷酸酶(AKP)；酸性磷酸酶(ACP)；谷胱甘肽還原酶(GR)

溫度和鹽度作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中兩個(gè)重要的環(huán)境因子，通常對(duì)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)、存活以及生理、免疫造成直接或間接的影響。近年來(lái)，海區(qū)溫度、鹽度等環(huán)境因子不斷改變，導(dǎo)致貝類(lèi)病害頻繁發(fā)生，造成海水貝類(lèi)大面積死亡，給養(yǎng)殖區(qū)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。因此，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注溫度和鹽度對(duì)貝類(lèi)免疫的影響。已有研究表明，溫度和鹽度的變化對(duì)菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[4]、雞簾蛤(Chameleagallina)[5]、中國(guó)血蛤(HiatulaChinese)[6]等貝類(lèi)血淋巴中各免疫指標(biāo)造成顯著影響。

華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)廣泛分布于我國(guó)南海、日本、印度尼西亞等地區(qū)，是一種暖水性經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)[7]。因其肉質(zhì)鮮美，生長(zhǎng)速度較快，現(xiàn)已經(jīng)成為我國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)[8]。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者先后研究了不同殼色和性腺成熟期華貴櫛孔扇貝類(lèi)胡蘿卜素的含量[9-10]；克隆了冷休克蛋白基因[11]；分析了在重金屬脅迫下華貴櫛孔扇貝類(lèi)金屬硫蛋白的周轉(zhuǎn)[12]；考察了環(huán)境因子對(duì)華貴櫛孔扇貝呼吸、排泄生理、生長(zhǎng)和存活[13-14]的影響；并研究了殼色與閉殼肌顏色遺傳規(guī)律[15]等內(nèi)容。但環(huán)境因子對(duì)華貴櫛孔扇貝免疫相關(guān)酶活力的影響研究較少，因此本文以華貴櫛孔扇貝為材料，采用響應(yīng)曲面法研究了溫度和鹽度的變化以及兩者間的聯(lián)合效應(yīng)對(duì)華貴櫛孔扇貝血淋巴中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和谷胱甘肽還原酶(GR)活力的影響，探索華貴櫛孔扇貝生存環(huán)境適宜、用于免疫調(diào)節(jié)的能量較少、生長(zhǎng)能力比較旺盛的溫度和鹽度組合，為華貴櫛孔扇貝的人工養(yǎng)殖條件的選擇提供免疫學(xué)方面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用華貴櫛孔扇貝取自海南三亞養(yǎng)殖場(chǎng)，隨機(jī)抽取一定數(shù)量的健康、活力較好的扇貝，平均殼長(zhǎng)為(62.33±4.48) mm，平均殼高為(67.74±3.80) mm。去除貝殼表面附著物，暫養(yǎng)于廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院無(wú)脊椎動(dòng)物養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室。暫養(yǎng)7 d后用于試驗(yàn)，暫養(yǎng)期間溫度為23.60～24.30 ℃，鹽度為26.20～27.10，投喂亞心型扁藻(Platymonassubcordiformis)，投餌密度(1～2)×104cell/mL。靜水條件下連續(xù)充氣，每2 d100%換水1次。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用中心復(fù)合法和響應(yīng)曲面法研究溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝3種免疫相關(guān)酶活性的聯(lián)合效應(yīng)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果得出華貴櫛孔扇貝適宜生存的溫、鹽度范圍，本試驗(yàn)中溫度范圍為19～31 ℃，鹽度范圍為22～38。溫度和鹽度在上述范圍內(nèi)各取3個(gè)水平，各因子水平的編碼值分別為-1.414,-1,0,1,1.414。整個(gè)試驗(yàn)共計(jì)13個(gè)溫度和鹽度交叉組合(表1)，中心點(diǎn)重復(fù)5次，星號(hào)臂α=±1.414。試驗(yàn)重復(fù)3次。為消除系統(tǒng)誤差，所有因子組合均隨機(jī)安排。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 華貴櫛孔扇貝血淋巴的采集

將暫養(yǎng)7 d后的華貴櫛孔扇貝按照表1組合，放入13個(gè)水桶中，每桶放入20只健康貝。按照表1組合將各桶扇貝的水溫和鹽度調(diào)節(jié)至相應(yīng)的溫度和鹽度組合，實(shí)驗(yàn)溫度控制按照栗志民等[16]的方法進(jìn)行，每天上調(diào)幅度或下調(diào)幅度為2 ℃；實(shí)驗(yàn)鹽度用經(jīng)曝氣的淡水和海水晶進(jìn)行調(diào)節(jié)，每天上調(diào)或下調(diào)幅度為2。溫度測(cè)定采用水銀溫度計(jì)測(cè)定，鹽度則采用鹽度計(jì)測(cè)定。

調(diào)節(jié)至相應(yīng)溫度和鹽度組合后繼續(xù)培養(yǎng)7 d，隨機(jī)抽取5只華貴櫛孔扇貝，用滅菌后的1 mL注射器在閉殼肌處抽取血淋巴，置于含有750 μL抗凝劑的1.5 mL離心管中，4 ℃下靜置1 h后，以4 500 r/min離心30 min，取上清液，即為血淋巴樣品，用于酶活力測(cè)定。

1.3.2 酶活的測(cè)定

酶活力測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。酸性磷酸酶活力單位定義為:100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)活力單位。堿性磷酸酶活力單位定義為:100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1活力單位。谷胱甘肽還原酶活力單位的定義為:在25 ℃，pH=7.5條件下，在1 min內(nèi)可以還原1 μmol氧化型谷胱甘肽時(shí)所用的酶量為1個(gè)活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以溫度和鹽度兩因子為自變量，以ACP，AKP，GR活力為因變量，建立酶活力和溫度、鹽度之間的回歸方程模型為：

(1)

式中，Y為響應(yīng)變量(ACP，AKP,GR活力);t為溫度一次效應(yīng);S為鹽度一次效應(yīng);t2為溫度二次效應(yīng);S2為鹽度二次效應(yīng);b0為常數(shù)項(xiàng);b1、b2為溫度和鹽度的一次效應(yīng)系數(shù);b3為溫度和鹽度的交互作用;b4、b5為溫度和鹽度的二次效應(yīng)系數(shù);ε為殘差，并假定其服從均值為0的正態(tài)分布。

采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由此建立影響因子與酶活力的回歸方程，并給出相應(yīng)的擬合度。對(duì)所建立的回歸方程進(jìn)行分析，可得到最優(yōu)的溫度和鹽度組合，其結(jié)果可通過(guò)響應(yīng)曲面來(lái)清晰展示。采用顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP活力影響的方差分析

表2為溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP活力影響的方差分析表，由表可知，所建立的回歸方程模型極顯著(P<0.01)，表明所建立的模型有效。失擬項(xiàng)F=2.00，P>0.05表明擬合的方程有效?；貧w方程的決定系數(shù)為98.66%、校正系數(shù)為97.70%、預(yù)測(cè)決定系數(shù)為93.45%，表明所擬合的方程擬合度極高，模型選擇恰當(dāng)。

表2 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP活力影響的方差分析

注：決定系數(shù)R2=98.66%;校正系數(shù)Adj.R2=97.70%;預(yù)測(cè)決定系數(shù)Pred.R2=93.45%；空白處無(wú)數(shù)據(jù)

由表3可知，回歸模型95%置信區(qū)間內(nèi)預(yù)測(cè)的最低值為178.48，最高值為192.06。系數(shù)估計(jì)是根據(jù)方差分析表中的編碼值得到的值，回歸方程中系數(shù)是非編碼值。表中影響因子溫度的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)ACP活力的影響極顯著(P<0.01)；鹽度的一次效應(yīng)對(duì)酶活力的影響顯著(P<0.05)，而二次效應(yīng)的影響極顯著(P<0.01)；溫度和鹽度的互作效應(yīng)對(duì)ACP活力的影響顯著(P<0.05)。

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，根據(jù)實(shí)際得到的ACP活力對(duì)溫度、鹽度的二次多項(xiàng)回歸方程為：

YACP=185.27+24.64t-6.77S+8.30t×S+35.89t2+35.68S2

(2)

式中,Y為ACP活力;t為溫度一次效應(yīng);S為鹽度一次效應(yīng);t2為溫度二次效應(yīng);S2為鹽度二次效應(yīng);t×S為溫度和鹽度互作效應(yīng)。

表3 溫度和鹽度對(duì)ACP活性影響回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

注：空白處無(wú)數(shù)據(jù)

2.2 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝AKP活力影響的方差分析

利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到AKP活力對(duì)溫度和鹽度的二次多項(xiàng)回歸方程為：

YAKP=174.59+26.95t-10.64S+13.26t×S+37.79t2+52.68S2

(3)

式中,Y為AKP活力；其他各參數(shù)含義同式(2)。

對(duì)該方程進(jìn)行方程分析和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，由表4可知，溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝AKP活力影響所建立的回歸模型極顯著(P<0.01)。失擬項(xiàng)F=5.30，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著(P>0.05)，表明擬合方程有效?；貧w方程的決定系數(shù)為98.13%、校正決定系數(shù)為96.80%、預(yù)測(cè)決定系數(shù)為88.80%，說(shuō)明所建立的方程與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合良好，因此可用該回歸方程進(jìn)行下一步的優(yōu)化分析。

表4 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝AKP活力影響的方差分析

注：決定系數(shù)R2=98.13%;校正系數(shù)Adj.R2=96.80%;預(yù)測(cè)決定系數(shù)Pred.R2=88.80%；空白處無(wú)數(shù)據(jù)

由表5可知，回歸模型95%置信區(qū)間內(nèi)預(yù)測(cè)最低值為164.50，最高值為184.68，表明建立的模型可靠性較高。系數(shù)估計(jì)是根據(jù)方差分析表中的編碼值得到的值，回歸方程中的系數(shù)是非編碼值。表中影響因子溫度和鹽度的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)以及互作效應(yīng)對(duì)華貴櫛孔扇貝AKP活力影響均顯著(P<0.05)。

表5 溫度和鹽度對(duì)AKP活性影響回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

注：空白處無(wú)數(shù)據(jù)

2.3 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝GR活力影響的方差分析

表6為溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝GR活力影響的方差分析表，由表可知，所建立的方程模型顯著性檢驗(yàn)P<0.05，表明模型擬合度極高。失擬項(xiàng)F=6.57，P>0.05，表明擬合方程有效，回歸方程的決定系數(shù)為95.76%，校正系數(shù)為92.74%，預(yù)測(cè)決定系數(shù)為73.84%，這表明所擬合的二次方程合適。根據(jù)所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到的二次方程為：

YGR=0.35+0.02t+0.015S+0.063t×S-0.067t2-0.059S2

(4)

式中，Y為GR活力；其他各參數(shù)含義同式(2)。

表6 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝GR活力影響的方差分析

注：決定系數(shù)R2=95.76%;校正系數(shù)Adj.R2=92.74%;預(yù)測(cè)決定系數(shù)Pred.R2=73.84%；空白處無(wú)數(shù)據(jù)

由表7可知，回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，溫度和鹽度的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)華貴櫛孔扇貝GR活力的影響顯著(P<0.05)；溫度和鹽度的交互作用對(duì)酶活力的影響顯著(P<0.05)。且試驗(yàn)因子與響應(yīng)變量間都不存在簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表7 溫度和鹽度對(duì)GR活性影響回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

注：空白處無(wú)數(shù)據(jù)

2.4 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP活力影響的響應(yīng)曲面分析

為了直觀考察溫度和鹽度兩因子及其交互作用對(duì)3種免疫相關(guān)酶活力的影響，實(shí)驗(yàn)建立了溫度和鹽度對(duì)響應(yīng)值影響的二次方程，并得到一組響應(yīng)曲面及其等高線，從而確定影響因子最佳水平范圍。曲面的形狀可反映出影響因素的顯著水平，曲面較陡說(shuō)明影響顯著，曲面平緩則說(shuō)明影響不顯著；等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱趨勢(shì)，橢圓表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[17]。

由圖1可知，溫度和鹽度對(duì)ACP活力影響的響應(yīng)曲面圖較陡，說(shuō)明兩因子對(duì)ACP活力影響顯著。當(dāng)溫度一定時(shí)，隨著鹽度的變化，ACP活力呈現(xiàn)先下降后上升的峰值變化；當(dāng)鹽度一定時(shí)，隨著溫度的升高，ACP活力先下降后上升。溫度為23.47 ℃、鹽度為30.77時(shí)，ACP活力最低為180.37 U/mg，其可靠性為0.98。由圖2可知，溫度和鹽度對(duì)ACP活力影響的等高線圖近似橢圓形，因此兩因子交互作用對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP活力的影響顯著(P<0.05)。溫度趨于24.15 ℃、鹽度趨于30時(shí)，ACP活力逐漸降低。

圖1 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP活力影響的響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface of temperature and salinity on the activity of ACP of Chlamys nobilis

圖2 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP活力影響的等高線圖Fig.2 Contour plot of effects of temperature and salinity on the activity of ACP of Chlamys nobilis

2.5 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝AKP活力影響的響應(yīng)曲面分析

由圖3可知，溫度和鹽度對(duì)AKP活性影響的響應(yīng)曲面圖形較陡，說(shuō)明溫度和鹽度兩個(gè)因子對(duì)AKP活力影響顯著。當(dāng)溫度一定時(shí)，AKP活力隨著鹽度的升高呈現(xiàn)先下降、后上升的趨勢(shì)；當(dāng)鹽度一定時(shí)，AKP活力隨著溫度的變化呈現(xiàn)出先下降、后上升的趨勢(shì)。溫度為23.38 ℃,鹽度為30.84時(shí)，AKP活力最低為168.63 U/mg，其可靠性為 0.99。由圖4可知，等高線圖近似橢圓形，因此溫度和鹽度的交互作用顯著(P<0.05)，且當(dāng)溫度趨于25 ℃、鹽度趨于30時(shí)，AKP活力最低。

圖3 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝AKP活力影響的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface of effects of temperature and salinity on the activity of AKP of Chlamys nobilis

圖4 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝AKP活力影響的等高線圖Fig.4 Contour plot of effects of temperature and salinity on the activity of AKP of Chlamys nobilis

2.6 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝GR活力影響的響應(yīng)曲面分析

從圖5可知，溫度和鹽度對(duì)ACP活力影響的響應(yīng)曲面較陡，說(shuō)明溫度和鹽度分別對(duì)ACP活力影響顯著。當(dāng)溫度一定時(shí)，隨著鹽度升高，GR的活性先升高后下降；當(dāng)鹽度一定時(shí)，隨著溫度的升高，GR的活性呈現(xiàn)先升高后下降的峰值變化。溫度和鹽度分別為26.17 ℃，31.56時(shí)，GR的活性最高0.35 U/mg，其可靠性為0.96。由圖6可知，溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝GR活力影響等高線圖為橢圓形，因此溫度和鹽度的交互作用對(duì)華貴櫛孔扇貝GR活力影響顯著(P<0.05)，溫度趨于24.15 ℃、鹽度趨于30時(shí)，GR的活性逐漸升高。

圖5 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝GR活力影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface of effects of temperature and salinity on the activity of GR of Chlamys nobilis

圖6 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝GR活力影響的等高線圖Fig.6 Contour plot of effects of temperature and salinity on the activity of GR of Chlamys nobilis

2.7 優(yōu) 化

以3種免疫相關(guān)酶的活力為因變量，通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察了溫度和鹽度兩個(gè)因子對(duì)ACP，AKP，GR活力的影響，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明溫度為24.30 ℃、鹽度為30.55時(shí)，ACP和AKP活力最低，分別為170.44，181.74 U/mg；而GR活力達(dá)到最大值0.34 U/mg，滿(mǎn)意度為0.95。為了進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)曲面優(yōu)化條件的可靠性，按所得最優(yōu)條件重新設(shè)計(jì)一組實(shí)驗(yàn)作為驗(yàn)證試驗(yàn)，所得的ACP，AKP和GR活力分別為168.79，180.99和0.32 U/mg，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，說(shuō)明模型優(yōu)化條件合理有效。

3 討 論

3.1 溫度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP，AKP和GR活性的影響

隨著季節(jié)的變化，水溫常常會(huì)發(fā)生改變。與其他水生動(dòng)物一樣，雙殼貝類(lèi)對(duì)水溫的改變比較敏感，因此貝類(lèi)的免疫也易隨之發(fā)生變化[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，溫度的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)ACP，AKP和GR活力影響顯著(P<0.05)，表明3種酶的活性均易受溫度的影響。ACP和AKP活力隨著溫度的升高呈現(xiàn)出先下降、后上升的變化趨勢(shì)。與ACP和AKP活力變化相反，GR活力隨溫度升高呈現(xiàn)出先升高、后下降的峰值變化。ACP和AKP改變的原因可能是低溫或高溫威脅到貝類(lèi)的正常生存，且高溫會(huì)導(dǎo)致大量病原體出現(xiàn)，從而華貴櫛孔扇貝需通過(guò)增強(qiáng)自身的免疫來(lái)抵御不良環(huán)境，保證機(jī)體正常的生理活動(dòng)，因此在溫度和鹽度改變一段時(shí)間后ACP和AKP的值有所升高[19]。GR活性變化的原因是高溫使得華貴櫛孔扇貝呼吸作用增強(qiáng)，產(chǎn)生大量的氧自由基將谷胱甘肽氧化，因此GR的活性增強(qiáng)以維持機(jī)體內(nèi)的氧自由基平衡[20]。李曉英等[21]對(duì)青蛤(Cyclinasinensis)的研究中發(fā)現(xiàn)，溫度驟升引起青蛤肝胰臟中ACP活性顯著升高; Chen等[22]報(bào)道了在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，櫛孔扇貝(ChlamysFarreri)中ACP活性呈現(xiàn)上升的變化趨勢(shì)；Liu[23]對(duì)海灣扇貝(Argopectensirradias)和櫛孔扇貝兩種扇貝研究發(fā)現(xiàn)，AKP活性受溫度影響顯著(P<0.05)，且當(dāng)溫度達(dá)到31 ℃時(shí)，兩種扇貝中AKP活性均達(dá)到最大。以上研究與本文研究結(jié)論一致，表明ACP和AKP受溫度影響顯著，且溫度高于最適存活溫度的一段范圍內(nèi)，ACP和AKP活力會(huì)顯著增加。溫度對(duì)GR活力影響在貝類(lèi)中研究較少，但在其他水生動(dòng)物中得到了廣泛研究。尹曉燕等[24]對(duì)草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)的研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)草魚(yú)腎細(xì)胞中GR活具有顯著影響(P<0.05)，隨著溫度的升高活性增強(qiáng)；Dorts等[25]報(bào)道了杜父魚(yú)(Cottusgobio)在熱應(yīng)激的情況下肝臟中GR活力顯著下降。本文研究也得出了類(lèi)似的結(jié)論，即在高溫刺激下，GR活力明顯下降，且顯著低于正常溫度條件下GR的活力。因此控制溫度對(duì)于華貴櫛孔扇貝的養(yǎng)殖以及病害的控制具有重要意義。

3.2 鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP，AKP和GR活性的影響

在貝類(lèi)養(yǎng)殖過(guò)程中，水體鹽度的改變能夠?qū)C(jī)體的滲透壓產(chǎn)生影響，從而影響生物體內(nèi)離子水平、能量代謝以及電解質(zhì)平衡，最終改變生物體內(nèi)與免疫相關(guān)的酶活性[26]。本研究結(jié)果顯示，鹽度的一次效應(yīng)和二次效應(yīng)對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP，AKP和GR活性影響顯著(P<0.05)，這表明3種酶活性易受到鹽度的影響，且存在最大或最小峰值。ACP和AKP活性隨著鹽度的升高呈現(xiàn)出先下降、后上升的峰值變化。與之相反，GR活性隨著鹽度的升高呈現(xiàn)出先升高、后下降的變化趨勢(shì)。ACP和AKP活性變化原因可能是由于低鹽和高鹽造成貝類(lèi)滲透壓嚴(yán)重的改變，貝類(lèi)為了調(diào)節(jié)滲透壓的平衡，需要大量的能量，而免疫水平也因此增強(qiáng)，所以ACP和AKP兩種酶的活性會(huì)升高[27]。當(dāng)鹽度適宜時(shí)，ACP和AKP活力較低的原因可能是由于環(huán)境條件適宜，貝類(lèi)免疫所需的能量較少，大部分能量用于貝類(lèi)的生長(zhǎng)，因此與免疫相關(guān)的酶活力相對(duì)較低[19]。GR呈現(xiàn)出與ACP和AKP變化趨勢(shì)相反的原因是鹽度逐漸升高時(shí)，貝類(lèi)的耗氧率呈現(xiàn)先升高、后下降的變化[27]，因此機(jī)體內(nèi)氧自由基的含量也呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，為了調(diào)節(jié)體內(nèi)氧自由基的平衡，GR的活性也相應(yīng)呈現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢(shì)。馬洪明等[28]研究發(fā)現(xiàn)鹽度突降能夠增強(qiáng)櫛孔扇貝血淋巴中ACP酶活性；時(shí)少坤等[29]研究表明，低鹽和高鹽脅迫下，近江牡蠣(OstrearivularisGould)AKP活性呈現(xiàn)出先降后升的變化。在對(duì)其他水生動(dòng)物的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)[30-32]了與本研究類(lèi)似的結(jié)論，即AKP和ACP活性在適宜鹽度條件下，活力較低。目前，研究鹽度對(duì)貝類(lèi)血淋巴中GR活性影響的成果較少，而在其他水生動(dòng)物中有相關(guān)報(bào)道。尹飛等[33]認(rèn)為低鹽度脅迫下銀鯧幼魚(yú)(Pampusargenteus)肝臟中GR活性得到增強(qiáng)；Rodrigues等[34]研究發(fā)現(xiàn)鹽度對(duì)青蟹(Carcinusmaenas)GR活性影響顯著(P<0.05)，隨鹽度升高GR活性增強(qiáng)，當(dāng)鹽度為25時(shí)，GR活性最高。與本文研究GR活性受鹽度影響的變化趨勢(shì)一致，表明低鹽或高鹽都不利于GR發(fā)揮作用。

3.3 溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP，AKP和GR活性的互作效應(yīng)

以往的研究多集中于單因子對(duì)水生動(dòng)物中ACP，AKP和GR的獨(dú)立影響，因而這些研究不能考察溫度和鹽度兩者間的交互作用對(duì)3種酶活性的影響。本試驗(yàn)采用復(fù)合設(shè)計(jì)，對(duì)溫度和鹽度的互作效應(yīng)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，溫度和鹽度的交互作用對(duì)華貴櫛孔扇貝血淋巴中ACP，AKP和GR活性影響顯著(P<0.05)。原因可能是溫度能夠改變3種酶的空間構(gòu)象，而鹽度則提供酶激活所需的金屬離子，因此兩者能夠共同促進(jìn)酶活性的調(diào)節(jié)。據(jù)報(bào)道，馬氏珠母貝(Pinctadamartensi)稚貝中ACP和AKP活力受溫度和鹽度交互作用影響顯著[19]；軍曹魚(yú)(Rachycentridae)幼魚(yú)肌肉中GR活性受到溫鹽聯(lián)合效應(yīng)的影響顯著[35]。以上報(bào)道與本文試驗(yàn)結(jié)果相一致，表明溫度和鹽度對(duì)3種酶均存在互作效應(yīng)。

目前，有關(guān)ACP和AKP的研究已經(jīng)建立了相應(yīng)的模型，但對(duì)于GR并未建立相應(yīng)模型。本試驗(yàn)通過(guò)建立可靠的模型，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)響應(yīng)的連續(xù)預(yù)測(cè)，這對(duì)貝類(lèi)生理和免疫的研究提供了可靠的因子條件支撐。方差分析結(jié)果顯示(表2,4,6)顯示，所建立的溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝ACP，AKP和GR活力影響的模型極顯著(P<0.01)，說(shuō)明模型建立恰當(dāng)，可以預(yù)測(cè)華貴櫛孔扇貝血淋巴中ACP，AKP和GR活力。

通過(guò)優(yōu)化得出，在溫度24.30 ℃、鹽度30.55時(shí)，ACP和AKP活力最低，而GR活力最大，反應(yīng)了此時(shí)華貴櫛孔扇貝生存環(huán)境適宜，用于免疫調(diào)節(jié)的能量較少，生長(zhǎng)能力比較旺盛，說(shuō)明在實(shí)際生產(chǎn)中，控制溫度24 ℃、鹽度31，華貴櫛孔扇貝生長(zhǎng)良好。

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Received: January 21, 2015

Synergistic Effects of Temperature and Salinity on the Activities of Immune-Related Enzymes ofChlamysnobilis(Reeve)

LI Zhi-min, QIAN Jia-hui, LAO Cui-ying, LIU Zhi-gang

(FisheriesCollege,GuangdongOceanUniversity, Zhanjiang 524025, China)

In order to provide a reference for disease control, culture and spreading ofChlamysnobilis,the synergistic effects of temperature (19～31 ℃) and salinity (22～38) on the activities of immune related enzymes of ACP, AKP and GR were studied using the central composite design (CCD) and response surface methodology (RSM). The results showed that the linear effects of temperature on the activities of ACP, AKP and GR were significant (P<0.05). And quadratic effects of temperature on the activities of three enzymes were also significant (P<0.05), which suggested that the activities of ACP, AKP and GR were easily be impacted by the temperature conditions. While the linear effects of salinity on the activities of ACP, AKP, GR were significant (P<0.05), and the quadratic effects of salinity on the ACP, AKP and GR were also significant (P<0.01). There existed significant synergistic effects between temperature and salinity on the activities of ACP, AKP and GR (P<0.05). Through response surface methodology, a model equation about the relationship of the activities of ACP, AKP and GR to the two factors was established, with theR2as high as 0.986 6, 0.981 3 and 0.957 6 (P<0.05)respectively, and the Pred.R2reached to 0.934 5，0.888 0 and 0.738 4, suggesting that the fitting capability of the model was practicably applied for prediction. Through the optimization of the reliable model, the activities of ACP, AKP reached their minimum(170.43, 181.74 U/mg) and the activity of GR reached the maximum (0.34 U/mg) when the 2-factor combination was 24.30 ℃/30.55, with the desirability value being 0.95.

Chlamysnobilis; response surface method; Alkaline Phosphatase(AKP); Acid Phosphatase(ACP); Glutathione Reductase(GR)

2015-01-21

廣東省教育廳項(xiàng)目——熱帶海產(chǎn)無(wú)脊椎動(dòng)物養(yǎng)殖工程研究中心建設(shè)項(xiàng)目(GCZX-A0909)

栗志民(1972-)，男，遼寧興城人，博士，副教授，主要從事經(jīng)濟(jì)無(wú)脊椎動(dòng)物生物學(xué)和增養(yǎng)殖方面研究. E-mail:lizhimin811@163.com

*通訊作者：劉志剛(1963-)，男,廣東潮州人,教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事經(jīng)濟(jì)無(wú)脊椎動(dòng)物增養(yǎng)殖方面研究.E-mail:lzg919@126.com

(王佳實(shí) 編輯)

S917.4

A

1671-6647(2015)02-0227-12