龐春艷 呂鳳鳳 尹芳蕊 王永福

(內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院風濕免疫研究所包醫(yī)一附院風濕免疫科，內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學重點實驗室，包頭014010)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一種可累積多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病，以腎臟受累多見，SLE 患者出現(xiàn)腎臟損害稱為狼瘡腎炎(Lupus Nephritis，LN)，對LN 的治療，若臨床癥狀輕微，腎小球結(jié)構(gòu)正常或輕微病變，可用抗瘧藥阿司匹林或NSAID 等治療，同時加用小劑量激素口服;若腎小球病變嚴重時，可采用激素加細胞毒藥物治療。SLE 患者合并LN 時預后較差，LN 的主要死因是腎功能衰竭和合并感染。如果及時地控制LN 的發(fā)展可延長SLE 患者的5 年存活率。

小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是一種特定基因沉默技術(shù)，廣泛用于腫瘤、自身免疫性疾病和肝炎等疾病的治療［1-3］，而且小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，口服siRNA 制劑對小鼠不會造成任何的不良反應［4］。因此，本研究采用siRNA 技術(shù)沉默MRL/Lpr 小鼠中CD40 基因的表達，探討CD40 基因的siRNA 對MRL/Lpr 小鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 載體pGFP-V-RS 購自美國Origene 公司，AxyPrep 質(zhì)粒DNA 大量抽提試劑盒購自美國Axygen 公司，TRIzol 購自日本Takara 公司，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和脂質(zhì)體lipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司。

1.2 siRNA 的設計和CD40-siRNA 是否在小鼠腎臟中表達 針對CD40 基因的cDNA 序列設計2 段siRNA。第1 段序列為:CTTGGAGGTCCTACAGAAA，第2段序列為:GTGTTATCCCTGGACAAGC。將上述序列的模板插入質(zhì)粒載體pGFP-V-RS 中，構(gòu)建其真核表達載體。將構(gòu)建好的60 μg CD40 siRNA1 和脂質(zhì)體lipofectamineTM2000 的混合物200 μl［DNA(μg):lipofectamineTM2000 (μl)為1∶2］分別自尾靜脈注射MRL/Lpr 小鼠，對照組小鼠注射等劑量、等比例的磷酸鹽緩沖液(PBS)和lipofectamineTM2000 的混合物，6 h 后處死小鼠取腎臟，快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察是否有綠色熒光。

1.3 實驗動物分組及給藥 12 周齡MRL/Lpr 雌性小鼠16 只，體質(zhì)量18～23 g，購南京大學動物模式研究所。按照簡單隨機化分組方法將小鼠分為對照組、空載體組、CD40 siRNA1 組和CD40 siRNA2 組4組，每組4 只。注射方法同上，空載體組小鼠注射載體pGFP-V-RS 與lipofectamineTM2000 的混合物。每隔1 天1 次，共6 次。

1.4 各項指標的檢測 注射后14 d 處死所有組MRL/Lpr 小鼠，心臟取血，分離血清。-80℃保存。取小鼠腎臟，分成兩份，其中一份TRIzol 提RNA，實時熒光定量PCR 檢測小鼠腎臟中CD40 mRNA 的表達水平，根據(jù)ct 值計算2-ΔΔct。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，CD40 上游引物:5'-GAGAAGACCCAATGCCACC-3'，下游引物:5'-GCACATGCCTCGCAATCC-3'，內(nèi)參β-actin 上游引物:5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3'，下游引物:5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'。另一份腎臟，4% 甲醛固定，石蠟包埋，切2 張片，分別作HE 染色和熒光免疫組織化學染色，熒光免疫組織化學染色的圖片采用IPP6 軟件分析平均A 值。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，以±s 表示，組間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CD40 siRNA 真核表達載體在腎臟中的表達

由于本實驗用到的質(zhì)粒載體pGFP-V-RS 含有綠色熒光蛋白，因此熒光顯微鏡下觀察冰凍切片，結(jié)果發(fā)現(xiàn):對照組小鼠腎臟中看不到綠色熒光，而CD40-siRNA1 組可看到明顯的綠色熒光，即CD40 siRNA真核表達載體可以在MRL/Lpr 小鼠腎臟中表達，見圖1。

圖1 CD40 siRNA 真核表達載體在小鼠腎臟中的表達Fig.1 Expression of CD40 siRNA in kidney from MRL/Lpr mice

2.2 4 組小鼠CD40 siRNA 注射后CD40 mRNA的表達水平 注射后14 d 處死小鼠，CD40-siRNA1 組和CD40-siRNA2 組小鼠腎臟中CD40 mRNA 的表達明顯低于對照組和空載體組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，對照組和空載體組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，CD40-siRNA1 組和CD40-siRNA2 組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 4 組小鼠CD40 siRNA 注射后CD40 蛋白的表達水平 注射后14 d 處死小鼠，檢測4 組小鼠腎臟中CD40 蛋白的表達，結(jié)果顯示:對照組和空載體組有很強的紅色熒光，而CD40-siRNA1 組和CD40-siRNA2 組的紅色熒光量明顯減弱，即CD40-siRNA1組和CD40-siRNA2 組CD40 的表達明顯低于對照組和空載體組，對照組和空載體組比較差異不明顯，siRNA1 組和siRNA2 組比較也無明顯差異。見圖2(附:上述應用的為熒光免疫組化，無需染色，放大倍數(shù)為10 倍)。

2.4 4 組小鼠的病理改變 光鏡下觀察腎臟的病理切片，結(jié)果發(fā)現(xiàn):對照組的腎小球炎性細胞浸潤，腫大，腎小管腫脹，可見管型，空載體組與對照組的病理類型一致，而CD40-siRNA1 組和CD40-siRNA2組中的小鼠腎臟病理顯示:腎小球和腎小球浸潤的炎性細胞減少，腎小管腫脹程度減輕，見圖3。

表1 4 組小鼠腎臟中CD40 mRNA 表達水平(±s)Tab.1 Expression levels of CD40 mRNA in kidney from MRL/Lpr mice(±s)

表1 4 組小鼠腎臟中CD40 mRNA 表達水平(±s)Tab.1 Expression levels of CD40 mRNA in kidney from MRL/Lpr mice(±s)

Note:Compared with control group and empty vector group，1)P＜0.05.

圖2 4 組小鼠腎臟中CD40 蛋白的表達水平Fig.2 Expression levels of CD40 protein in kidney from MRL/Lpr mice

2.5 4 組小鼠CD40 siRNA 注射后24 h 尿蛋白的變化 24 h 尿蛋白檢測結(jié)果顯示:CD40-siRNA1 組和CD40-siRNA2 組中的小鼠24 h 尿蛋白的 濃 度 分 別 為(202.50 ± 26.30)mg/dl 和(201.25 ±28.39)mg/dl 顯著低于對照組和空載體組狼瘡鼠的濃度，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.6 4 組小鼠CD40 siRNA 注射后補體C3 的表達水平 注射后14 d 處死小鼠，CD-40 siRNA1組和CD-40 siRNA2 組小鼠血清中補體C3 的表達明顯高于對照組和空載體組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，對照組和空載體組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，CD-40 siRNA1 組和CD-40 siRNA2 組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見圖4。

圖3 4 組小鼠腎組織病理學改變(HE，×200)Fig.3 Changes of renal histopathology in MRL/Lpr mouse (HE，×200)

表2 4 組小鼠24 h 尿蛋白的濃度(±s，mg/dl)Tab.2 Urinary Protein content of MRL/Lpr mice in 4 groups(±s，mg/dl)

表2 4 組小鼠24 h 尿蛋白的濃度(±s，mg/dl)Tab.2 Urinary Protein content of MRL/Lpr mice in 4 groups(±s，mg/dl)

Note:Compared with control group and empty vector group，1)P＜0.05.

圖4 4 組小鼠補體C3 的表達水平Fig.4 Expression level of complement C3 in serum of MRL/Lpr

3 討論

LN 是SLE 累及腎臟所引起的一種免疫復合物性腎炎，除SLE 全身表現(xiàn)外，臨床主要表現(xiàn)為不同程度的蛋白尿、血尿、腎功能不全等，可表現(xiàn)為不同的病理學分類。人類白細胞分化抗原CD40 是與T細胞和B 細胞功能有關的一種表面抗原。CD40 與其配體CD40L 形成信號通路在自身免疫炎癥中起重要作用［5，6］。同時，CD40 還可激活SLE 患者B 細胞，使其增殖和分化能力增強，免疫球蛋白(IgS)分泌增多［7］。

本研究將2 段CD40 的siRNA 真核表達載體尾靜脈注射MRL/Lpr 小鼠，6 h 后處死小鼠取腎臟制作冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)MRL/Lpr 小鼠腎臟可見綠色熒光，說明CD40 siRNA 真核表達載體可在小鼠腎臟中表達。CD40 的mRNA 和蛋白水平的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):CD40 的特異性siRNA 可抑制MRL/Lpr小鼠腎臟中CD40 在mRNA 和蛋白水平的表達。

LN 腎臟病理可見腎小球有大量中性粒細胞浸潤、腫脹，腎小管出現(xiàn)空泡樣改變和管型，是SLE 主要的合并癥和死亡原因。MRL/Lpr 小鼠會出現(xiàn)輕中度蛋白尿和進行性腎損害，病理表現(xiàn)為炎細胞浸潤、血管炎以及間質(zhì)小管病變，腎小球系膜和血管環(huán)中可見呈輕微顆粒型IgG 免疫復合物和補體C3，與人類LN 相似［8］。本研究狼瘡鼠腎臟病理切片顯示，模型組的腎小球腫脹，且有大量淋巴細胞浸潤，腎小管出現(xiàn)空泡樣改變，符合LN 腎臟的病理改變。MRL/Lpr 小鼠尾靜脈注射CD40 的特異性siRNA 后可發(fā)現(xiàn)腎小球腫脹減輕，淋巴細胞浸潤減少，腎小管空泡樣改變減輕，而注射空載體的狼瘡鼠腎臟卻沒有這樣的改變，空載體組腎臟的病理改變和模型組基本一致，沒有明顯變化。這說明CD40 的siRNA可逆轉(zhuǎn)LN 的腎臟病理改變。

SLE 患者合并LN 時會出現(xiàn)不同程度的蛋白尿，如及時合理地進行治療蛋白尿的程度可以逐漸減輕。Luo 等［9］將B 淋巴細胞誘導成熟蛋白1(B lymphocyte-induced maturation protein-1，Blimp-1)的siRNA 載體注射MRL/Lpr 小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Blimp-1的siRNA 可減輕抗dsDNA 抗體的滴度，減少24 h尿蛋白的含量，減弱SLE 的相關癥狀等。本研究在CD40 siRNA 注射MRL/Lpr 小鼠尾靜脈后，結(jié)果顯示:24 h 尿蛋白的含量較模型組和空載體組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義。這提示CD40 的siRNA 可減少MRL/Lpr 小鼠的24 h 尿蛋白的含量。

SLE 患者由于形成大量循環(huán)免疫復合物，補體被大量消耗，其下降程度與病情活動程度呈平行關系，患者表現(xiàn)為低補體血癥。免疫復合物沉積腎小球可引起狼瘡腎炎，臨床上通常將補體C3 作為判斷狼瘡腎炎活動度的指標［10，11］。本研究結(jié)果顯示:CD40 的siRNA 可以升高MRL/Lpr 小鼠血清中補體C3 水平。提示CD40 的siRNA 在一定程度上可以減輕狼瘡小鼠體內(nèi)的免疫反應，減輕LN 的活動度。

總之，CD40 的siRNA 真核表達載體尾靜脈注射MRL/Lpr 小鼠后，CD40 siRNA 可以在其腎臟中表達，可減少CD40 mRNA 和蛋白的表達水平，同時減少24 h 尿蛋白的含量，逆轉(zhuǎn)腎臟的病理改變，進一步還可升高MRL/Lpr 小鼠體內(nèi)的補體C3 水平，緩解LN 的活動度，因此，CD40 siRNA 對LN 有治療作用。

［1］Gillespie DL，Aguirre MT，Ravichandran S，et al.RNA interference targeting hypoxia-inducible factor 1α via a novel multifunctional surfactant attenuates glioma growth in an intracranial mouse model［J］.J Neurosurg，2015，1222(2):331-341.

［2］Guo B，Zhang B，Zheng L，et al.Therapeutic RNA interference targeting CKIP-1 with a cross-species sequence to stimulate bone formation［J］.Bone，2014，59:76-88.

［3］Thongthae N，Payungporn S，Poovorawan Y，et al.A rational study for identification of highly effective siRNAs against hepatitis B virus［J］.Exp Mol Pathol，2014，97(1):120-127.

［4］Petrick JS，Moore WM，Heydens WF，et al.A 28-day oral toxicity evaluation of small interfering RNAs and a long double-stranded RNA targeting vacuolar ATPase in mice［J］.Regul Toxicol Pharmacol，2014，71(1):8-23.

［5］Peters AL，Stunz LL，Bishop GA.CD40 and autoimmunity:the dark side of a great activator［J］.Semin Immunol，2009，21:293-300.

［6］Pyrovolaki K1，Mavroudi I，Sidiropoulos P，et al.Increased expression of CD40 on bone marrow CD34+hematopoietic progenitor cells in patients with systemic lupus erythematosus:contribution to Fas-mediated apoptosis［J］.Arthritis Rheum，2009，60 (5):543-552.

［7］Néron S，Boire G，Dussault N，et al.CD40-activated B cells from patients with systemic lupus erythematosus can be modulated by therapeutic immunoglobulins in vitro［J］.Arch Immunol Ther Exp(Warsz).2009，57(6):447-458.

［8］丁朝霞，楊少鋒，吳啟富，等.白芍總苷對MRL/lpr 小鼠狼瘡性腎炎的影響［J］.南方醫(yī)科大學學報，2011，31(4):656-660.

［9］Luo J，Niu X，Zhang M，et al.Inhibition of B lymphocyte-induced maturation protein-1 reduces the production of autoantibody and alleviates symptoms of systemic lupus erythematosus［J］.Autoimmunity，2015，48(2):80-86.

［10］Julkunen H1，Ekblom-Kullberg S，et al.Nonrenal and renal activity of systemic lupus erythematosus:a comparison of two anti-C1q and five anti-dsDNA assays and complement C3 and C4［J］.Rheumatol Int..2012，32(8):2445-2451.

［11］Li W，Li H，Song W，Hu Y，et al.Differential diagnosis of systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis with complements C3 and C4 and C-reactive protein［J］.Exp Ther Med，2013，6(5):1271-1276.