李登瑞 楊永輝 李 輝 郭素敏 朱桂云 李秀武 耿書軍 趙榮娣 任雪飛 高 莉 辛 欣

(河北省胸科醫(yī)院，河北省肺癌防治中心，石家莊 050041)

現(xiàn)在腫瘤對人類生存健康的威脅越來越嚴重，對腫瘤的治療方法也發(fā)生著越來越多的變化，各種各樣的腫瘤治療已經顯現(xiàn)出來，成為治療腫瘤的重要發(fā)展方向。繼腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)及CD3 單抗激活的殺傷細胞(CD3AK)后，自然殺傷細胞(Nature killer，NK)的殺瘤作用日益顯現(xiàn)出來［1，2］。NK 細胞是將人外周血、臍帶血或骨髓的單個核細胞在體外多種細胞因子(干擾素、白介素等)作用下培養(yǎng)一段時間后獲得的一群細胞。NK 細胞的過繼治療在抗病毒、抗腫瘤的治療中有著廣泛的應用前景，在造血干細胞移植后減少移植物抗宿主反應中的作用也倍受關注［2］。由于NK 細胞在外周血中所占的比例很少，建立一種有效的NK 細胞體外擴增系統(tǒng)是深入研究NK 細胞功能與探討NK 細胞免疫治療的基礎。體外獲取人NK 細胞主要有兩種途徑:一是采用抗NK細胞特異性抗體與磁珠交聯(lián)的方法，從PBMC 中分離人NK 細胞;二是采用刺激擴增培養(yǎng)的方法，從PBMC 中擴增培養(yǎng)人NK 細胞［3］。與其他過繼性免疫治療細胞相比，NK 還具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、副作用小、對正常骨髓造血影響輕微等優(yōu)點。因此，NK 細胞的應用被認為是新一代腫瘤過繼免疫治療的首選方法。

NK 細胞體外大量擴增并且獲得強大的細胞毒活性與多種細胞因子的作用有著密切關系，這些細胞因 子 包 括IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN-γ 以 及CD3McAb 等［4，5］。通過體外的刺激培養(yǎng)可進行相對大規(guī)模的NK 細胞制備，使臨床應用成為可能。但是迄今為止多數(shù)的體外刺激擴增培養(yǎng)也只能使NK 細胞在體外擴增數(shù)十到百倍，且純度也不理想。在本文研究中，我們采用基因工程方法，在K562 細胞上表達IL-6 基因，構建特定的K562 工程細胞作為刺激細胞。IL-6 基因與一段特殊的跨膜蛋白基因融合，使IL-6 蛋白在K562 細胞中表達后錨定于細胞膜表面。其次，以γ 射線照射致死的K562 工程細胞作為刺激細胞，以人外周血單個核細胞(PBMC)為擴增培養(yǎng)對象，通過與IL-6 的共刺激作用，使NK 細胞在體外培養(yǎng)條件下得到大量的擴增。用4 h51Cr 釋放實驗檢測NK 細胞對K562 細胞殺傷水平的影響。用NK 細胞作用K562 細胞的毒活性進行功能分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 臍帶血來源于白求恩國際和平醫(yī)院，K562 細胞來自河北省腫瘤醫(yī)院科研中心。RPMI1640 培養(yǎng)基、0.25%胰酶為美國Gibco 公司產品，淋巴細胞分離液購自德國GE 公司。流式細胞熒光標記抗體、IL-2、IL-15、IL-6 購自美國PeproTech 公司。流式細胞儀為美國BECKMAN-COULTER 公司。CO2培養(yǎng)箱為美國Thermo 公司。

1.2 表達IL-6 的重組K562 細胞的構建 采用RT-PCR 方法分別從人單核細胞(PBMC)中擴增IL-6 cDNA，測序正確后，IL-6 基因克隆至CD8 信號肽的下游。重組的IL-6 亞克隆至含有不同篩選標記的真核表達載體，先后脂質體轉染K562 細胞后，篩選穩(wěn)定表達的細胞克隆，構建K562 工程細胞株。K562 細胞與PBMC 共培養(yǎng)前，用γ 射線照射致死。

1.3 NK 細胞的誘導 將12 份(每組4 份)人外周血分離出單核細胞，制備成細胞懸液，同時加入IL-2和IL-15 到培養(yǎng)袋中進行培養(yǎng)，標號實驗組和對照組。第1 組為實驗組，加入IL-2 和IL-15，再另加射線滅活的同等數(shù)量的重組K562 細胞，第6 天起每隔3 d 對孔中的液體半換液，同時設以下兩個平行對照組:第2 組加入IL-2 和IL-15，再加入IL-6 作用組;第3 組為空白對照組，加入IL-2 和IL-15。然后加入RPMI1640 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)擴增，每天觀察細胞生長并根據(jù)情況進行擴增。

1.4 免疫熒光染色和流式細胞術分析(FCM)NK細胞表型 培養(yǎng)21 d 后收集細胞因子刺激的PBMC細胞，調整細胞數(shù)，為1 ×107ml-1，加入細胞懸液50 μl(用DPBS 稀釋)滅活正常兔血清，室溫作用10 min。加入CD(16 +56)-PE 和CD3-FITC 進行膜表面雙色熒光標記，對照組加入PE IgG1 和FITC IgG1，作用30 min。用洗滌液洗滌2 次。加適量固定液，用流式細胞術進行細胞分類分析，確定CD56+CD16+CD3-細胞的比例。

1.551Cr 釋放實驗法檢測細胞毒活性 效應細胞為人白血病細胞株K562。將K562 細胞懸液置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期K562 細胞，調整細胞數(shù)為2.0 × 106ml-1，加入51Cr 3.7 MBq，37℃孵育1.5 h，中間每隔15 min 晃動1次。標記完畢后洗滌3 次，調整靶細胞數(shù)至1.0 ×105ml-1，加入96 孔U 型板，100 μl/ 孔。收集細胞因子刺激的PBMC，按照不同的效靶比加入含有預先標記K562 細胞的96 孔U 型板中，37℃孵育4 h，380 r/min 離心5 min，收集上清液每孔100 μl，用 計數(shù)儀測定CPM 值，按以下公式如下:

2 結果

2.1 構建重組K562D3 細胞 ABCDE 五組實驗，第D 組第3 批次重組的K562 細胞穩(wěn)定表達IL-6，我們將其命名為K562D3 細胞，我們以后做的所有實驗都用這一批次的重組細胞，以區(qū)別于靶細胞K562。成功構建了表達IL-6 的重組K562D3 細胞。射線照射后的K562 細胞經過連續(xù)2 周的培養(yǎng)，存活細胞消失。照射后的重組K562 細胞在3～7 d 內依然具有完整的細胞形態(tài)，與PBMC 混合后，照射過的重組K562 細胞在第7 天后破碎并被逐漸吞噬干凈。

2.2 NK 細胞的增長曲線 動態(tài)監(jiān)測NK 細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)3 組NK 細胞均在培養(yǎng)第3 天開始增殖，培養(yǎng)第14 天進入快速增長期，到20 d 增殖速度達到最快。20 d 以后進入平臺期。3 組細胞懸液中都加入IL-2 和IL-15，第1 組為加射線滅活的同等數(shù)量的重組K562 細胞:第2 組為加入IL-6 作用組;第3 組為空白對照組。3 組間的NK 細胞增殖存在著不同。實驗組第1 組NK 細胞生長得快，而且細胞數(shù)量多，對照組第1 組、第2 組的NK 細胞生長不如第1 組NK 細胞生長得快和數(shù)量多。每組4 份細胞，到23 d 時，第1 組CD56+CD16+CD3-細胞數(shù)量比單個核細胞數(shù)量擴增了(760 ±18)倍。第2 組CD56+CD16+CD3-細胞數(shù)量比單個核細胞數(shù)量擴增了(216 ±5)倍。第3 組CD56+CD16+CD3-細胞數(shù)量比單個核細胞數(shù)量擴增了(23 ±1)倍。統(tǒng)計學分析差異顯著，P＜0.05。結果見圖1。

2.3 擴增的NK 細胞表面標記分析 對第3 組重組的K562工程細胞刺激擴增的NK細胞進行純度檢測，采用流式細胞術進行分子表面標記物CD56、CD16、CD3 分析。結果證實，經過23 d 的刺激培養(yǎng)后，流式細胞儀檢測到PBMC 細胞表面標記物CD56+CD3-的純度增多;擴增前是6% ±0.4%，擴增后是91% ±2%(圖2)。

圖1 NK 細胞的增殖曲線Fig.1 Curve of cell proliferation of NK cell

2.4 不同條件下誘導的NK 細胞對K562 腫瘤細胞的殺傷率 由表1 可見，在相同效靶比下誘導的NK細胞殺傷率1 組明顯最大，說明1 組NK 細胞對K562 的殺傷作用最強。2、3 組次之。而在相同條件下誘導的NK 細胞，其在效靶比為20∶1 時，對K562 細胞的殺傷率均明顯高于10∶1。統(tǒng)計學分析差異顯著，P＜0.05。

3 討論

NK 細胞是先天免疫中一類重要的細胞，通過細胞毒作用和分泌細胞因子參與機體抗感染和抗腫瘤免疫［6，7］。因其作用不需初次免疫活化，因而在過繼免疫治療上有其獨特的應用前景。由于不能獲得數(shù)量大、純度高的人NK 細胞，使NK 細胞在免疫治療中的應用受到了限制。采用體外擴增的方法獲得足夠數(shù)量和較高純度的人NK 細胞，是近年來研究NK 細胞功能特別是探討過繼免疫治療的一個重要基礎平臺。尤其是對手術后或者放、化療后患者效果顯著，能消除殘留的轉移病灶，防止癌細胞的擴散，提高機體自身的免疫力［8］。

圖2 流式細胞儀檢測NK 細胞表型Fig.2 Immunophenotypic analysis of NK cell surface markers was performed by flow cytometry

表1 不同條件誘導的NK 細胞對K562 腫瘤細胞的殺傷率Tab.1 Cytotoxicity of NK cells to K562 cells cultured in different conditions

人正常的外周血中含有極少量的NK 細胞，PBMC 在體外經過多種細胞因子誘導后獲得大量的NK 細胞。這些細胞因子包括IL-2、IL-15、單克隆抗體等［9］。上述這些擴增方法獲得的NK 細胞似乎還不能滿足過繼免疫治療的需要，NK 細胞的增殖、活化、殺傷及分泌等功能，僅僅靠可溶性細胞因子的刺激還很難使NK 細胞得到大量的擴增。國內外學者在擴增的方法上進行了各種的探索，如采用磁株分選的方法先從人PBMC 中分離NK 細胞，獲得的NK細胞在體外培養(yǎng)條件下，用可溶性IL-2、IL-12、IL-15等細胞因子共同刺激，能使NK 細胞擴增數(shù)十倍［10，11］。除了細胞因子外，K562、HFWT 等腫瘤細胞也能夠刺激NK 細胞的擴增，采用照射致死的K562 細胞或HFWT 細胞與PBMC 共培養(yǎng)，也能使PBMC 中的NK 細胞得到一定的擴增［12，13］。IL-6 的生物學活性:①刺激細胞生長:IL-6 可促進多種細胞的增殖，如B 淋巴細胞雜交瘤、漿細胞瘤、EBV 轉化的B 細胞、T 細胞、PMA 和IL-4 刺激的胸腺細胞、造血干細胞、角朊細胞和腎小球系膜細胞。②促進細胞分化:如B 細胞分化和Ig 的分泌，CTL 分化，協(xié)同IL-2 增強CTL 中穿孔素基因的表達，并增加T 細胞IL-2 產生和IL-2R 表達，誘導巨噬細胞、神經細胞和NK 細胞分化。協(xié)同IL-3 促進干細胞分化和巨核細胞的成熟，明顯促進小鼠骨髓移植后免疫功能的重建。

本實驗結果與以往結果相比［12，14］，在數(shù)量上，沒有將多個細胞因子如IL-15、IL-18 和4-1BBL 三種基因共同表達，只表達一種IL-6 基因的重組K562，得到NK 細胞的數(shù)量多、純度高和活性強，這是一個突破。本研究在以膜蛋白形式表達非可溶形式的IL-6 的基礎上，構建了表達IL-6 的重組K562 細胞，結果表明用重組的K562 擴增的NK 細胞，其細胞毒活性比IL-6 單獨擴增的NK 細胞提高了約10%，擴增倍數(shù)達到了760 倍。本擴增方法獲得NK 細胞95%殺傷率和91%純度高，操作簡單，只是表達了一種非可溶性基因，也可以達到很高的擴增和純度。

本研究為CIK 細胞進一步應用于臨床腫瘤治療奠定了基礎，其有關作用機理還需要進一步探索。

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