文坤明 冷 敏 程家平 陳正權(quán) 陳奕霖 曾慶良 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，遵義 563003)

腫瘤對(duì)化療藥物多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)是影響其化療效果的關(guān)鍵原因，腫瘤耐藥的機(jī)制包括:機(jī)體或腫瘤基因或表觀遺傳發(fā)生改變、腫瘤微環(huán)境改變或阻止化療藥物進(jìn)入細(xì)胞等，其中腫瘤細(xì)胞高表達(dá)ABC 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporters，ABC transporters)，將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的化療藥物泵出細(xì)胞，使化療藥物無法達(dá)到有效濃度從而發(fā)生耐藥在腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制中起了重要作用［1］。P-糖蛋白(P-gp)由耐藥基因MDR-1 編碼，是ABC 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族一員，結(jié)腸癌細(xì)胞高表達(dá)P-gp 是影響治療效果的主要障礙之一［2］。研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)P-gp 的基因MDR-1 存在受STAT3調(diào)控的啟動(dòng)子結(jié)合域，STAT3 可調(diào)控P-gp 表達(dá)在腫瘤耐藥中起作用［3］。本項(xiàng)目擬研究具有抗癌活性的姜黃素(Curcumin，Cur)對(duì)具有MDR 特性的人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑(Oxaliplatin，Oxa)細(xì)胞株(SW620/OxR)的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制是否與抑制STAT3 信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。將SW620 細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS)的L-15 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按照我們之前報(bào)道的方法建立穩(wěn)定的耐藥細(xì)胞株［4］:在SW620 細(xì)胞的培養(yǎng)液中最初加入濃度0.1 μmol/L 的Oxa，加藥后大部分細(xì)胞死亡，少量存活細(xì)胞繼續(xù)生長，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)予傳代處理，傳3 代后提高Oxa 濃度，由0.1 μmol/L 提高到0.5 μmol/L，同樣的處理方法由0.5 μmol/L 提高到1.0 μmol/L，最終達(dá)臨床血藥濃度2.0 μmol/L，至少傳5 代以上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，最終所建立的穩(wěn)定的耐藥細(xì)胞稱為SW620/OxR。

1.2 相關(guān)試劑 奧沙利鉑及姜黃素購自美國Sigma 公司;細(xì)胞增殖檢測試劑WST-1 購自瑞士Roche公司;L-15 培養(yǎng)基購于北京邁成生物有限公司;胎牛血清(FBS)購自美國Gibco 公司;兔抗人P-STAT3(pY705)抗體購自美國Eptomics 公司、鼠抗人P-gp抗體購自美國Santa-Cruz 公司;鼠抗人β-actin 一抗、山羊抗鼠、山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。

1.3 細(xì)胞增殖活性檢測 為了選擇合適濃度的Cur 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，我們首先測定了姜黃素對(duì)耐藥細(xì)胞的IC50 值(半數(shù)抑制濃度)。Cur 用二甲基亞砜(DMSO)溶解配置成濃度為500 mmol/L 于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成目標(biāo)濃度(DMSO 終濃度均＜0.1%)。

采用細(xì)胞增殖檢測試劑WST-1 檢測細(xì)胞增殖活性。將耐藥細(xì)胞SW620/OxR 接種于96 孔板，細(xì)胞數(shù)量為3 000 個(gè)/孔，培養(yǎng)液為含10%FBS 的L-15培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn)報(bào)道的姜黃素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用濃度［5］，我們選擇5 個(gè)梯度濃度的Cur 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在接種12 h 細(xì)胞貼壁生長后，將細(xì)胞暴露于含Cur濃度分別為0、1、5、10、20、30 μmol/L 的培養(yǎng)基中，每種濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后(文獻(xiàn)報(bào)道［5，6］，姜黃素對(duì)結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞的IC50 檢測時(shí)間選擇在加藥后24～48 h，本研究檢測時(shí)間定為加藥后48 h)，酶標(biāo)儀在570nm(OD570)波長下進(jìn)行吸光度檢測。檢測前10 min，根據(jù)WST-1 試劑盒操作說明在每孔中加入10 μl WST-1 試劑震蕩混勻。按照我們之前報(bào)道的方法［4］，計(jì)算加藥后細(xì)胞相對(duì)于未加藥對(duì)照組的存活細(xì)胞百分率，并且進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)?？紤]到Cur 與Oxa可能存在協(xié)同殺傷癌細(xì)胞的作用，并且為了盡量減小高濃度藥物所致的不良反應(yīng)，我們選擇的Cur 藥物濃度為IC50 前一濃度來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 為了明確Cur 對(duì)耐藥細(xì)胞凋亡的影響，我們將SW620/OxR 分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(后面的實(shí)驗(yàn)與之相同)，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液為含2 μmol/L Oxa 及10%FBS 的L-15 培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中另外增加IC50 前一濃度的Cur。取指數(shù)生長期SW620/OxR 細(xì)胞進(jìn)行傳代，待12 h 細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)的培養(yǎng)液各3 ml(50 ml 培養(yǎng)瓶)，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在加藥后48 h，0.25%胰酶消化收集每組細(xì)胞，每個(gè)樣本細(xì)胞數(shù)量約為1×106，采用Annexin V/PI 雙染色法，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限為中晚期凋亡(死亡)細(xì)胞，總的細(xì)胞凋亡率按早期凋亡細(xì)胞加中晚期凋亡細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)中的百分率計(jì)算。

1.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá) P-STAT3 和P-gp蛋白檢測采用Western blot 方法。實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理方法同1.4，使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，采用反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞，加入適量的裂解液(每100 μl 裂解液中加入1 μl 蛋白酶抑制劑)充分混勻裂解30 min，按(Pierce BAC protein Assay Kit)蛋白定量試劑盒操作說明進(jìn)行濃度測定，加入上樣緩沖液煮沸10 min 使蛋白充分變性，-80℃凍存?zhèn)溆?進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的上樣量為40 μg，6%或10%的SDS-PAGE膠分離蛋白，采用濕法轉(zhuǎn)膜將相應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入一抗稀釋液(P-STAT3:1∶2 000，P-gp:1∶500)，4℃過夜孵育;PBST洗膜3 次，每次10 min;分別加入稀釋比例均為1∶5 000的山羊抗兔及山羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h;PBST 洗膜3 次;ECL 發(fā)光并拍照;采用Quantity-One 軟件對(duì)條帶的吸光度值進(jìn)行半定量分析，目的蛋白的相對(duì)量=目的條帶的吸光度值/內(nèi)參β-actin 蛋白條帶的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果 不同濃度Cur 作用于SW620/OxR細(xì)胞后48h，采用細(xì)胞增殖檢測試劑WST-1 檢測的存活細(xì)胞百分率結(jié)果見圖1，Cur對(duì)SW620/OxR 細(xì)胞的IC50 濃度為18.9 μmol/L。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們使用的Cur 濃度為10 μmol/L。

圖1 不同濃度Cur 作用于SW620/OxR 細(xì)胞48 h 后存活細(xì)胞百分率Fig.1 Effect on percentage of surviving cells after 48 h with Cur of different concentrations conducted in SW620/OxR cells

圖2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率Fig.2 Cells apoptosis rate in control group and experimental group detected by flow cytometry

2.2 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 將SW620/OxR 細(xì)胞暴露于含10 μmol/L 的Cur、2 μmol/L 的Oxa 及10%FBS 的L-15 培養(yǎng)液中與不含Cur 的對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡率由(5.08± 1.82)% 上升到(30.69 ±2.94)%，10 μmol/L 的Cur 作用于SW620/OxR 細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率明顯增高(P＜0.05)，見圖2。

2.3 P-STAT3 及P-gp 表達(dá)結(jié)果 Western blot 檢測結(jié)果提示，P-STAT3 及P-gp 蛋白分別由對(duì)照組的(0.23 ±0.04)及(0.75 ±0.12)，下降到實(shí)驗(yàn)組的(0.09 ±0.01)及(0.16 ±0.04)，加藥后的實(shí)驗(yàn)組兩種蛋白表達(dá)明顯低于未加藥的對(duì)照組(P 均＜0.05)，提示Cur 能明顯抑制P-STAT3 及P-gp 蛋白的表達(dá)。圖3 為其中一次檢測結(jié)果。

圖3 Western blot 檢測對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組P-STAT3、P-gp蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 Protein expression levels of P-STAT3 and P-gp in control group and experimental group detected by Western blot

3 討論

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率位于惡性腫瘤的第3 位［7］，手術(shù)和化療是其主要的治療方法。盡管在過去的十幾年時(shí)間內(nèi)，手術(shù)及化療均取得了明顯的進(jìn)展，但均未能明顯改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，復(fù)發(fā)率仍維持在50%左右，MDR 是導(dǎo)致CRC 治療失敗的主要原因之一［8］。因此，研究結(jié)腸癌耐藥機(jī)制，尋找逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌MDR 的策略對(duì)改善結(jié)腸癌患者的預(yù)后具有重要意義。

耐藥細(xì)胞株的建立為研究耐藥機(jī)制并尋找逆轉(zhuǎn)的方法提供了較好的研究平臺(tái)。我們?cè)谥暗难芯恐校晒⒘巳私Y(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株——SW620/OxR，已證實(shí)其具有MDR 特性［4］。Cur 是從姜黃根莖中提取出的主要活性物質(zhì)，其具有抗癌活性［6-9］，并且研究還發(fā)現(xiàn)其能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥［6］。我們首先確定了Cur 對(duì)SW620/OxR 細(xì)胞是否具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。

為了選擇適當(dāng)濃度的Cur 進(jìn)行研究，我們首先采用細(xì)胞增殖試劑WST-1 檢測了Cur 對(duì)耐藥細(xì)胞的IC50 值。結(jié)果提示，Cur 對(duì)SW620/OxR 細(xì)胞的IC50 濃度為18.9 μmol/L，見結(jié)果2.1?？紤]到Cur與Oxa 可能存在協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，并盡量降低高藥物濃度的Cur 對(duì)細(xì)胞的毒副作用，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們選擇10 μmol/L 的Cur 作用于SW620/OxR 細(xì)胞。采用流式細(xì)胞技術(shù)測定該濃度的Cur 對(duì)耐藥細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果提示，加藥后48 h，細(xì)胞凋亡率為(30.69 ±2.94)%，而未加藥的對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(5.08 ±1.82)%，提示10 μmol/L 的Cur 導(dǎo)致SW620/OxR 細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)，見結(jié)果2.2。以上結(jié)果表明Cur 作用于耐藥細(xì)胞后能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，顯著增加細(xì)胞凋亡率，提示Cur 對(duì)具有MDR 特性的結(jié)直腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞SW620/OxR 具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。

STAT3 信號(hào)通路激活參與了多種腫瘤的MDR［3，10］。我們?cè)谥暗难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)，SW620/OxR 細(xì)胞相對(duì)于其親本細(xì)胞SW620，STAT3 激活的標(biāo)志磷酸化STAT3(p-STAT3)明顯高表達(dá)［4］，P-gp表達(dá)也明顯增高［11］，說明STAT3 信號(hào)通路激活及P-gp 高表達(dá)可能參與了結(jié)腸癌的MDR。研究還發(fā)現(xiàn)，編碼P-gp 的基因MDR-1 存在受STAT3 調(diào)控的啟動(dòng)子結(jié)合域，STAT3 可調(diào)控P-gp 表達(dá)在腫瘤耐藥中起作用［3］。我們進(jìn)一步研究了姜黃素逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥是否與抑制STAT3 通路，降低P-gp 表達(dá)有關(guān)。Western blot 檢測結(jié)果提示，加入10 μmol/L 的Cur 48 h 后的實(shí)驗(yàn)組較未加藥的對(duì)照組P-STAT3 及P-gp 表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，見結(jié)果2.3，提示姜黃素可抑制SW620/OxR 細(xì)胞的STAT3 信號(hào)通路并明顯降低P-gp 表達(dá)。

綜上所述，我們的研究顯示，姜黃素能夠明顯抑制具有MDR 特性的人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞增殖，能夠明顯增加細(xì)胞凋亡，說明其具有調(diào)控人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞耐藥性的作用，其作用機(jī)制可能與抑制STAT3 信號(hào)通路并明顯降低P-gp 表達(dá)有關(guān)。

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