陳松彪 張春杰 程相朝 李銀聚 李 靜 何 雷 郁 川 張明亮 余祖華 賈艷艷 趙戰(zhàn)勤
(河南省動(dòng)物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,洛陽 471003)
鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)是一群非適應(yīng)性或泛嗜性的沙門菌,具有廣泛的宿主,是目前世界各國分離率最高的菌型之一。該菌能引起各種哺乳動(dòng)物以及人類發(fā)生全身性感染,具有重要的公共衛(wèi)生意義[1]。
沙門菌的致病機(jī)制主要與Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)有關(guān),由SPI-1 和SPI-2 兩個(gè)毒力島編碼,毒力島(Pathogenicity island)是存在于病原菌染色體上的特定區(qū)域,編碼與毒力相關(guān)的基因,負(fù)責(zé)細(xì)菌效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn),通過改變宿主細(xì)胞的生理機(jī)能來促進(jìn)細(xì)菌的侵入與存活。因此,T3SS 所分泌的蛋白在利用宿主細(xì)胞促進(jìn)細(xì)菌侵入,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),以及創(chuàng)造胞內(nèi)生小境來促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的存活和復(fù)制等方面發(fā)揮著重要作用[2]。
沙門菌入侵蛋白是侵入過程的起始中心,sipB是編碼沙門菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其中一個(gè)基因,已有研究表明SipB 可以調(diào)節(jié)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)調(diào)節(jié)蛋白的傳遞[3]。越來越多的證據(jù)表明位于毒力島1(SPI-1)上的SipB 效應(yīng)蛋白主要通過天冬氨酸特異性蛋白酶1(caspase-1)激活I(lǐng)L-1b 和IL-18 促進(jìn)宿主細(xì)胞的壞死和凋亡[4,5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)SipB 蛋白能夠插入到宿主的細(xì)胞膜中形成一個(gè)離子通道,從而能夠改變效應(yīng)蛋白在宿主細(xì)胞中的位置[6],SipB 蛋白在維持細(xì)菌細(xì)胞膜完整性和耐高滲性方面扮演著重要的角色[7]。而crp 基因編碼腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白,其突變株能在普通培養(yǎng)基上生長,消除了細(xì)菌在哺乳動(dòng)物中攝取cAMP 的唯一途徑,其作為沙門菌重要的毒力基因,國內(nèi)外學(xué)者一直在不斷地研究[8,9]。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)crp 和sipB缺失株均能夠顯著降低對(duì)哺乳動(dòng)物的毒力[10,11],但是這種毒力的降低是由什么機(jī)制引起的目前尚少見有關(guān)報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上對(duì)crp 和sipB 缺失株的其他生物學(xué)特性進(jìn)一步的研究,以小鼠和細(xì)胞建立感染模型,分別對(duì)兩種缺失株進(jìn)行體內(nèi)和體外的侵襲力試驗(yàn),為crp 和sipB 缺失株的減毒機(jī)制研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1.1 菌株、細(xì)胞和培養(yǎng)條件 鼠傷寒沙門菌SL1344 強(qiáng)毒株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng);SL1344Δ sipB、SL1344Δ crp、HeLa 細(xì)胞由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;鼠傷寒沙門菌在37℃靜止或振搖培養(yǎng);細(xì)胞在37℃和5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 生化鑒定試劑由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn);沙門菌屬診斷血清(11 種)及各種單因子血清由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn);DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Sigma 公司;Triton X-100 購自Sangon 公司。麥康凱瓊脂和SS 瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;胰蛋白胨、酵母浸出物等由英國OXOID 公司生產(chǎn);6 周齡的BALB/c 小鼠購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(豫)2010-0002]。
1.3 Δcrp 和ΔsipB 缺失株的表型鑒定 將缺失株利用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定,同時(shí)將兩株缺失株與SL1344 分別接種于含1%麥芽糖的麥康凱固體培養(yǎng)基上,研究菌落生長狀況;然后挑單菌落轉(zhuǎn)接含葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、甘露醇、麥芽糖糖等生化鑒定管,研究其生化特性。
1.4 Δcrp 和ΔsipB 缺失株的生長特性鑒定 將兩株缺失株與親本株SL1344 在LB 中37℃培養(yǎng)過夜,無菌生理鹽水連續(xù)10 倍稀釋,取100 μl 適當(dāng)稀釋度菌液均勻涂布于LB 固體平板上,每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù),37℃培養(yǎng)過夜,計(jì)數(shù),取平均值計(jì)算原液的CFU。然后以終濃度約為106CFU/ml 轉(zhuǎn)接于相同液體培養(yǎng)基,37℃、200 r/min 培養(yǎng),每1 h 取樣并進(jìn)行涂板計(jì)數(shù),繪制生長曲線。
1.5 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染小鼠后在體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布 6 周齡BALB/c 小鼠(16 只/每組)口服crp、sipB 缺失株1 ×107CFU,每周每組解剖4 只,共3組,并且取其肝、脾研磨進(jìn)行稀釋計(jì)數(shù),連續(xù)測(cè)定4周,并設(shè)親本菌株對(duì)照組。
1.6 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染上皮細(xì)胞黏附試驗(yàn)感染前16 h 將細(xì)胞按照按每孔1 ×105細(xì)胞接種于24 孔板;將細(xì)菌調(diào)至OD600=0.4,用無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基洗3 次,按100∶1 的細(xì)菌/細(xì)胞比例調(diào)整細(xì)菌濃度,加入1 ml/孔至細(xì)胞培養(yǎng)板,900 r/min離心10 min,37℃5%CO2作用2 h;PBS 洗3 次,加入300 μl 的胰酶作用5 min,再加入700 μl 5%BSAPBS 吹勻,稀釋涂板,培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù),以黏附的細(xì)菌數(shù)/接種細(xì)菌數(shù)計(jì)算黏附率。每次試驗(yàn)重復(fù)2 孔,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.7 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染上皮細(xì)胞侵入試驗(yàn) 參照Dong[12]的方法將細(xì)胞按照每孔1 ×106細(xì)胞接種于6 孔板;將細(xì)菌調(diào)至OD600=0.4,用無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基洗三次,按100∶1的細(xì)菌/細(xì)胞比例調(diào)整細(xì)菌濃度,加入1 ml/孔至細(xì)胞培養(yǎng)板,900 r/min 離心10 min,37℃5%CO2作用2 h;PBS 洗3 次,在PBS 洗3 次后,換含100 μg/ml 慶大霉素的DMEM 作用90 min;PBS 洗3 次,再加入1 ml 含0.1% Triton X-100 的PBS,吹勻,PBS 稀釋涂板,培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù),以侵入的細(xì)菌數(shù)/接種細(xì)菌數(shù)計(jì)算侵入率。每次試驗(yàn)重復(fù)2 孔,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析用SPSS13.0 軟件進(jìn)行,各組間差異比較采用t 檢驗(yàn),P<0.05 或P<0.01 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 Δcrp 和ΔsipB 缺失株的表型鑒定 親本菌株SL1344 和SL1344ΔsipB 在含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈紅色菌落,可利用麥芽糖,而SL1344Δcrp 不能利用麥芽糖,在含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈無色菌落(見圖1)。生化試驗(yàn)結(jié)果表明,SL1344ΔsipB 利用碳源的能力與SL1344基本相同,但SL1344Δcrp 與親本菌株相比,只保留了利用葡萄糖的能力,不能夠利用半乳糖、麥芽糖、木糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇(表1)。
2.2 Δcrp 和ΔsipB 缺失株生長特性鑒定 將缺失株SL1344Δcrp、SL1344ΔsipB 及親本株SL1344 菌液濃度均調(diào)整至1 ×106CFU/ml 為起始濃度開始振蕩培養(yǎng),每隔1 h 取樣進(jìn)行涂板計(jì)數(shù),結(jié)果顯示,SL1344ΔsipB 和親本菌株SL1344 生長速度沒有明顯差異,而SL1344Δcrp 較親本菌株相比發(fā)生了顯著的降低(圖2)。
2.3 Δcrp 和ΔsipB 缺失株免疫小鼠后在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布 基因缺失株實(shí)驗(yàn)組和親本株對(duì)照組的小鼠均口服免疫1 ×107CFU 劑量的菌液,親本株在肝、脾內(nèi)的細(xì)菌數(shù)顯著高于各缺失株,并于1 周內(nèi)全部死亡。其中crp 基因缺失組在各臟器分離到的細(xì)菌數(shù)目高于sipB 缺失組,兩組實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌均是在肝中逐漸被清除,到第4 周被基本清除;在脾臟中的細(xì)菌到接種后第4 周仍保持低水平的細(xì)菌數(shù)(見表2)。
2.4 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染上皮細(xì)胞黏附和侵入試驗(yàn) 由圖3 可知,當(dāng)HeLa 細(xì)胞細(xì)胞形成單層后,以100MOI 的量接種親本株或缺失株細(xì)菌,黏附試驗(yàn)表明,sipB 基因缺失組的黏附率(圖3A)和侵入率(圖3B)顯著低于對(duì)照組,而crp 基因?qū)嶒?yàn)組與對(duì)照組無明顯差異。
圖1 SL1344、SL1344ΔsipB 和SL1344Δcrp 在培養(yǎng)基上的生長情況Fig.1 Growth of SL1344,SL1344ΔsipB and SL1344-Δcrp on medium
圖2 缺失菌株SL1344ΔsipB、SL1344Δcrp 與親本菌株SL1344 的CFU 生長曲線Fig.2 Growth curves of SL1344ΔsipB,SL1344Δcrp and SL1344 base on CFU
圖3 SL1344△sipB、SL1344△crp 和SL1344 對(duì)HeLa 細(xì)胞的黏附率和侵入率試驗(yàn)Fig.3 Adherence and intracellular assay of SL1344,SL1344△sipB and SL1344△crp to HeLa cells
表1 SL1344,SL1344Δcrp 和SL1344ΔsipB 生化特性比較Tab.1 Comparison of biochemical characteristics of SL1344,SL1344Δcrp and SL1344ΔsipB
表2 免疫后4 周內(nèi)細(xì)菌在BALB/c 小鼠體內(nèi)的分布Tab.2 Distribution of bacteria in BALB/c mice on 4 weeks post-inoculation
鼠傷寒沙門菌具有非連續(xù)的侵入非吞噬細(xì)胞的能力,細(xì)菌的效應(yīng)蛋白穿過宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜主要由一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與完成的,這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括SipB、SipC、SipD,這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能形成一個(gè)通道使細(xì)菌的一些效應(yīng)蛋白通過細(xì)胞膜[13]。在沙門菌感染紅細(xì)胞過程中需要上述三個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白形成一個(gè)功能性小孔,它們?cè)谏抽T菌侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞過程中扮演著非常重要的角色[14]。其中SipB 是SPI-1 T3SS 的效應(yīng)蛋白,與細(xì)菌侵入有關(guān)。Santos 等[15]報(bào)道在鼠傷寒沙門菌感染牛巨噬細(xì)胞早期sipB 缺失株能夠顯著降低巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡。我們?cè)谘芯窟^程中也發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌SL1344 株sipB 的基因缺失株能夠降低對(duì)小鼠的致病性,但機(jī)制尚不清楚,因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)構(gòu)建的缺失株進(jìn)行了后續(xù)研究。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),和sipB 同樣位于SPI-1 上的編碼腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白crp 基因缺失株通過消除消除了細(xì)菌在哺乳動(dòng)物中攝取cAMP 的唯一途徑,影響參與碳水化合物、氨基酸和小肽代謝的廣泛功能及影響菌毛與鞭毛的表達(dá)和降低其生長增殖速度等途徑來降低其毒力[16,17]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)crp 基因缺失株失去了利用麥芽糖、半乳糖、山梨醇等的能力,并且生長速度與親本菌株相比也發(fā)生了顯著的下降,兩者的結(jié)論相一致。而sipB 基因缺失株仍然保持著利用麥芽糖、半乳糖、山梨醇等的能力,并且其生長速度較親本菌株相比沒有發(fā)生明顯的變化,說明sipB 基因缺失后不影響菌株參與碳水化合物、氨基酸和小肽代謝等功能。通過構(gòu)建小鼠感染模型和上皮細(xì)胞感染模型對(duì)缺失株進(jìn)行侵襲力比較。在小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布結(jié)果表明缺失菌株較親本菌株相比在肝臟和脾臟分離到的細(xì)菌數(shù)明顯的低于親本菌株,并且均能很快地被清除,實(shí)驗(yàn)組間對(duì)比發(fā)現(xiàn)sipB缺失組在各臟器分離到的細(xì)菌數(shù)低于crp 缺失組,說明sipB 基因缺失實(shí)驗(yàn)組對(duì)小鼠內(nèi)臟器官的毒力和侵襲力下降更明顯,細(xì)胞的黏附和侵入試驗(yàn)結(jié)果顯示缺失sipB 基因后能夠顯著降低對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和侵入能力,而crp 基因缺失株實(shí)驗(yàn)組與親本菌株對(duì)照組無明顯差別,均與前面的小鼠試驗(yàn)?zāi)P徒Y(jié)果相一致。通過以上試驗(yàn)結(jié)果說明sipB 基因缺失株可能是通過降低對(duì)機(jī)體的內(nèi)臟器官和上皮細(xì)胞的黏附和入侵能力來達(dá)到降低毒力的目的,而crp基因缺失株可能通過影響參與碳水化合物、氨基酸和小肽代謝的廣泛功能及影響菌毛與鞭毛的表達(dá)和降低其生長增殖速度等途徑來降低其毒力。
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