邵素芳 于春美 (山東省濰坊市益都中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，濰坊 262500)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，雖然發(fā)病率低于宮頸癌和宮體癌，但致死率卻占各類婦科腫瘤的首位。卵巢癌早期癥狀不典型，早期診斷困難，尚缺乏有效的治療手段。目前卵巢癌的發(fā)病機制尚不明確，可能與內(nèi)分泌、遺傳、精神及機體免疫功能等因素有關。輔助性T 細胞17(T help cell 17，Th17)/調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T cell，Treg)是新近發(fā)現(xiàn)的兩種CD4+T 細胞亞群，機體正常狀態(tài)下，Th17/Treg 細胞之間保持平衡，參與了機體的免疫應答及免疫耐受，而Th17/Treg 細胞失衡在炎癥反應、移植物抗宿主反應、自身免疫性疾病及腫瘤中起重要作用［1-5］。國內(nèi)外學者研究證實Treg細胞在卵巢癌患者體內(nèi)數(shù)量、功能異常，可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關［6-8］。有關Th17 細胞與卵巢癌的研究較少，有學者研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌患者的腫瘤組織中Th17 細胞數(shù)量增加［9，10］。為了進一步研究Th17/Treg 細胞在卵巢癌中作用，本研究檢測了卵巢癌患者外周血中Th17/Treg 細胞百分率、相關核轉(zhuǎn)錄因子retinoid-related orphan receptor gamma-t(RORγt)/foxhead winged-helix box protein 3(Foxp3)mRNA 的表達及血漿中相關細胞因子白細胞介素17(Interleukin-17，IL-17)/轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)的水平，旨在了解Th17/Treg 細胞在卵巢癌中的變化并初步探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象及樣本收集 收集2013 年10 月至2014 年5 月期間在濰坊市益都中心醫(yī)院婦產(chǎn)科住院手術治療的卵巢癌患者55 例，年齡34～72 歲，平均年齡(56.84±14.26)歲，所有病例均經(jīng)病理證實為上皮性卵巢癌，其中漿液性囊腺癌32 例，黏液性囊腺癌20 例，內(nèi)膜樣癌2 例，透明細胞癌1 例。根據(jù)2000 年國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)修訂的卵巢癌臨床分期標準，Ⅰ期6 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期27 例，Ⅳ期2 例。所有病例排除感染、自身免疫性疾病及嚴重心肝腎疾病，采集樣本前未進行手術、化療及免疫治療。同期女性健康體檢者60 例為正常對照組。無菌采取抗凝靜脈血5.0 ml，2 000 r/min 離心10 min 分離血漿，-20℃保存?zhèn)溆?，利用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用于流式細胞和RNA 提取。

1.2 主要試劑 FITC 標記鼠抗人CD4 抗體、Alexa Fluor?647 標記鼠抗人IL-17 抗體、PE 標記鼠抗人FoxP3 抗體購自美國BD 公司，TRIZOL 液購自美國Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ反應液購自大連寶生物工程有限公司，人IL-17、TGF-β1 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自美國R＆D 公司。

1.3 主要儀器 流式細胞儀為美國BD 公司產(chǎn)品，型號為BD FACS calibur;熒光定量PCR 擴增儀為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品，型號為Bio-Rad iQ5 Real Time PCR;冷凍高速離心機為德國Eppendorf 公司產(chǎn)品，型號為Eppendorf 5804R。

1.4 實驗方法

1.4.1 Th17 細胞檢測 調(diào)整單個核細胞懸液濃度至1 ×106ml-1，取100 μl 細胞懸液，加入PMA(終濃度100 ng/ml)、離子霉素(終濃度500 ng/ml)刺激4 h 后，加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(終濃度1 μl/ml)。加入10 μl FITC-CD4 抗體進行細胞表面染色，避光孵育30 min 后洗滌細胞，加入2 ml 固定液孵育20 min，洗滌細胞后加入2 ml 破膜液孵育30 min 后，洗滌細胞加入10 μl Alexa Fluor?647-IL-17 抗體后孵育20 min，洗滌重懸細胞，上流式細胞儀進行檢測。

1.4.2 Treg 細胞檢測 調(diào)整單個核細胞懸液濃度至1 × 106ml-1，取100 μl 細胞懸液，加入10 μl FITC-CD4 抗體進行細胞表面染色，避光孵育30 min后洗滌細胞，分別加入固定液、破膜液孵育洗滌細胞，加入10 μl PE-Foxp3 抗體，孵育20 min，洗滌重懸細胞，上流式細胞儀進行檢測。

1.4.3 RORγt/Foxp3 mRNA 水平檢測 分離單個核細胞，利用TRIZOL 液提取細胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA 鏈合成，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。利用Primer Premier 5.0 軟件設計、合成RORγt、Foxp3 及內(nèi)參GAPDH 引物，具體序列如下:RORγt 5'-CAGAGCCAAGGCTCAGTCAT-3'，5'-CCTCACAGGTGATAACCCCG-3'，產(chǎn)物大小103 bp;Foxp3 5'-CACTGCTGGCAAATGGTGTC-3'，5'-GTTTCCATGGCTACCCCACA-3'，產(chǎn)物大小380 bp;GAPDH 5'-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3'，5'-AGTGATGGCA TGGACTGTGG-3'，產(chǎn)物大小231 bp。采用50 μl 反應體系進行PCR 擴增:SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ反應液20 μl、上下游引物各2.0 μl、cDNA 4.0 μl、雙蒸水22 μl。反應條件:95℃20 s 預變性，95℃5 s、60℃20 s、72℃30 s，共45 個循環(huán)。擴增結(jié)束后自動獲得擴增曲線和循環(huán)閾值(CT 值)，mRNA 的相對表達用2-ΔΔCT表示，其中ΔΔCt=實驗組ΔCt (目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)-對照組ΔCt(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)。

1.4.4 血漿中IL-17/TGF-β1 水平檢測 利用人IL-17、TGF-β1 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測血漿中IL-17/TGF-β1 水平，每個樣本做3 個復孔，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌患者及正常對照組外周血中Th17/Treg細胞百分率的比較 實驗結(jié)果顯示卵巢癌患者外周血中CD4+IL-17+/CD4+T 細 胞 百 分 率 為(1.29±0.31)%，與正常對照組(0.81±0.19)%相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖1A。與正常對照組(9.17±2.95)%相比，卵巢患者外周血CD4+Foxp3+Treg/CD4+T 細胞百分率(12.48±3.35)%顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖1B。

2.2 卵巢癌患者及正常對照組外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 水平的比較 RORγt/Foxp3 是Th17/Treg 細胞發(fā)育和成熟的關鍵調(diào)控因子［11-14］，我們采用熒光定量PCR 檢測了RORγt/Foxp3 mRNA 的表達水平，實驗結(jié)果顯示:卵巢癌患者外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 表達水平分別為(0.43±0.22，0.54±0.26)，與正常對照組外周血RORγt/Foxp3 mRNA 表達水平(0.31±0.14，0.39±0.17)相比顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖2。

2.3 卵巢癌患者及正常對照組血漿中IL-17/TGFβ1 水平的比較 IL-17/TGF-β1 是Th17/Treg 細胞發(fā)揮效應的主要分子［15-17］，我們利用ELISA 檢測了血漿中IL-17/TGF-β1 的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，卵巢癌患者血漿中IL-17/TGF-β1 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，具體見表1。

圖1 卵巢癌患者及正常對照組外周血中Th17/Treg 細胞百分率的比較Fig.1 Compare of percentage of Th17/Treg cells in peripheral blood between patients with ovarian cancer and normal controls

圖2 卵巢癌患者及正常對照組外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 水平的比較Fig.2 Compare of mRNA expression of RORγt/Foxp3 in peripheral blood between patients with ovarian cancer and normal controls

表1 卵巢癌患者及正常對照組血漿中IL-17/TGF-β1 水平的比較(±s)Tab.1 Compare of plasma levels of IL-17/TGF-β1 between patients with ovarian cancer and normal controls (±s)

表1 卵巢癌患者及正常對照組血漿中IL-17/TGF-β1 水平的比較(±s)Tab.1 Compare of plasma levels of IL-17/TGF-β1 between patients with ovarian cancer and normal controls (±s)

Note:Compared with normal controls，1)P ＜0.05.

3 討論

Th 細胞前體在抗原的刺激下分化成Th0 細胞，Th0 細胞在不同細胞因子、抗原及抗原提呈細胞等因素的作用下可以分化成不同的CD4+T 細胞亞群，1995 年Sakaguchi 等［18］首次證實Treg 是一群具有免疫抑制作用的CD4+T 細胞亞群，在自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤和移植免疫中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌、肺癌、胰腺癌、胃腸道腫瘤等實體瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者外周血及腫瘤組織內(nèi)Treg 細胞數(shù)量明顯增多，抑制機體抗腫瘤免疫，促進了腫瘤發(fā)生發(fā)展［5，19，20］。我們的實驗發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者外周血中Treg 細胞百分率增高，這與國內(nèi)外研究結(jié)果基本一致，提示Treg 細胞參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展［6-8］。Th17 細胞是在研究自身免疫性疾病過程中逐漸被發(fā)現(xiàn)的，目前普遍認為Th17 細胞是一群獨立的CD4+T 細胞亞群。盡管研究證實Th17細胞在炎癥反應及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，但關于Th17 細胞與腫瘤關系的研究較少且有爭議，Th17 細胞發(fā)揮抗腫瘤作用還是抑制腫瘤作用尚存在爭議［21-24］。國外學者研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者的腫瘤組織中Th17 細胞增多，且Th17 細胞的數(shù)量與疾病的分級分期有關［9，10］。本實驗檢測了卵巢癌患者外周血中Th17 細胞的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者外周血中Th17 細胞百分率增多，與Th17 細胞在腫瘤組織中的結(jié)果基本一致。

國內(nèi)外學者研究證實RORγ/tFoxp3 是Th17/Treg 細胞發(fā)育和成熟的關鍵調(diào)控因子［11-14］，在Th17/Treg 細胞的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用，而IL-17/TGF-β1 是Th17/Treg 細胞的主要效應分子［15-17］。為了進一步證實卵巢癌患者外周血中Th17/Treg 細胞的變化，我們還檢測了外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 水平及血漿中IL-17/TGF-β1水平，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者外周血中RORγt/Foxp3 mRNA 水平及血漿中IL-17/TGF-β1 水平均增高，與Th17/Treg 細胞百分率變化一致。綜合我們及國內(nèi)外的研究結(jié)果推測［6-10］:卵巢癌患者無論是外周血還是腫瘤組織局部Th17/Treg 細胞數(shù)量均明顯增高，Treg 細胞主要通過在外周和腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用來發(fā)揮促腫瘤效應，而Th17 細胞主要是通過分泌IL-17 發(fā)揮促炎癥反應和促腫瘤血管生成來促進腫瘤生長。

綜上所述，卵巢癌患者外周血中Th17/Treg 細胞數(shù)量增多，參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程。進一步研究Th17/Treg 細胞在卵巢癌發(fā)病的不同時期的變化及二者之間的關系，將有助于全面了解卵巢癌患者機體的免疫狀態(tài)，為卵巢癌的治療提供新的策略。

［1］Weaver CT，Hatton RD.Interplay between the TH17 and TReg cell lineages:a (co-)evolutionary perspective［J］.Nat Rev Immunol，2009，9(12):883-889.

［2］Noack M，Miossec P.Th17 and regulatory T cell balance in autoimmune and inflammatory diseases［J］.Autoimmun Rev，2014，13(6):668-677.

［3］Hanidziar D，Koulmanda M.Inflammation and the balance of Treg and Th17 cells in transplant rejection and tolerance［J］.Curr Opin Organ Transplant，2010，15(4):411-415.

［4］Ye J，Livergood RS，Peng G.The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity［J］.Am J Pathol，2013，182(1):10-20.

［5］Whiteside TL.Regulatory T cell subsets in human cancer:are they regulating for or against tumor progression?［J］.Cancer Immunol Immunother，2014，63(1):67-72.

［6］Barnett B，Kryczek I，Cheng P，et al.Regulatory T cells in ovarian cancer:biology and therapeutic potential［J］.Am J Reprod Immunol，2005，54(6):369-377.

［7］Leffers N，Gooden MJ，de Jong RA，et al.Prognostic significance of tumor-infiltrating T-lymphocytes in primary and metastatic lesions of advanced stage ovarian cancer［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(3):449-459.

［8］荊結(jié)線，喬麗娟，郭愛芝，等.卵巢癌患者外周血CD4+CD25hiCD127lo調(diào)節(jié)性T 細胞格局變化及臨床意義［J］.中國免疫學雜志，2012，28(1):49-54.

［9］Kryczek I1，Banerjee M，Cheng P，et al.Phenotype，distribution，generation，and functional and clinical relevance of Th17 cells in the human tumor environments［J］.Blood，2009，114 (6):1141-1149.

［10］Fialová A，Partlová S，Sojka L，et al.Dynamics of T-cell infiltration during the course of ovarian cancer:the gradual shift from a Th17 effector cell response to a predominant infiltration by regulatory T-cells［J］.Int J Cancer，2013，132(5):1070-1079.

［11］Manel N，Unutmaz D，Littman DR.The differentiation of human T(H)-17 cells requires transforming growth factor-beta and induction of the nuclear receptor RORgammat［J］.Nat Immunol，2008，9(6):641-649.

［12］Michel ML，Mendes-da-Cruz D，Keller AC，et al.Critical role of ROR-gammat in a new thymic pathway leading to IL-17-producing invariant NKT cell differentiation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(50):19845-19850.

［13］Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］.Science，2003，299(5609):1057-1061.

［14］Marson A，Kretschmer K，F(xiàn)rampton GM，et al.Foxp3 occupancy and regulation of key target genes during T-cell stimulation［J］.Nature，2007，445(7130):931-935.

［15］Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al.IL-17 and Th17 cells［J］.Annu Rev Immunol，2009，27:485-517.

［16］Kullberg MC，Hay V，Cheever AW，et al.TGF-beta1 production by CD4+CD25+regulatory T cells is not essential for suppression of intestinal inflammation［J］.Eur J Immunol，2005，35(10):2886-95.

［17］Deng B，Zhu JM，Wang Y，et al.Intratumor hypoxia promotes immune tolerance by inducing regulatory T cells via TGF-β1 in gastric cancer［J］.PLoS One，2013，8(5):e63777.

［18］Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases［J］.J Immunol，1995，155(3):1151-1164.

［19］Bordon Y.Tumour immunology:dealing with regulators［J］.Nat Rev Immunol，2013，13(12):846-847.

［20］Savage PA，Malchow S，Leventhal DS.Basic principles of tumorassociated regulatory T cell biology［J］.Trends Immunol，2013，34(1):33-40.

［21］De Simone V，Pallone F，Monteleone G，et al.Role of TH17 cytokines in the control of colorectal cancer［J］.Oncoimmunology，2013，2(12):e26617.

［22］Middleton GW，Annels NE，Pandha HS.Are we ready to start studies of Th17 cell manipulation as a therapy for cancer?［J］.Cancer Immunol Immunother，2012，61(1):1-7.

［23］Wilke CM，Kryczek I，Wei S，Zhao E，et al.Th17 cells in cancer:help or hindrance?［J］.Carcinogenesis，2011，32(5):643-649.

［24］Qi W，Huang X，Wang J.Correlation between Th17 cells and tumor microenvironment［J］.Cell Immunol，2013，285(1-2):18-22.