呂學(xué)文 王 博 李揚(yáng)秋 (暨南大學(xué)血液病研究所，廣州 510632)

外周T 細(xì)胞淋巴瘤(PTCL)是起源于成熟細(xì)胞或稱胸腺后細(xì)胞的惡性腫瘤，CHOP 方案常用于其一線治療。細(xì)胞免疫功能缺陷是腫瘤形成的一大原因，我們前期研究發(fā)現(xiàn)PTCL 患者外周血中CD4+的比例明顯降低，CD8+的比例明顯升高，CD4+CD45RO+細(xì)胞明顯降低，而CD4+CD45RA+細(xì)胞比例明顯升高，考慮PTCL 病人胸腺近期輸出功能仍較強(qiáng)［1］。為了進(jìn)一步了解CHOP 方案化療后病人的初始T 細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞的變化情況，我們?cè)黾恿藰颖玖?，并分析化療前后初始T 細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞的變化，目的在于了解化療對(duì)初始T 細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞的影響，探討其對(duì)臨床治療及預(yù)后的檢測(cè)意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集廣東省農(nóng)墾中心醫(yī)院2011 年5 月～2014 年6 月經(jīng)組織形態(tài)學(xué)和免疫組化確診的初治PTCL 患者20 例，其中男11 例，女9 例，年齡16～72 歲，平均年齡為(47.90±18.30)歲，均符合PTCL 診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，10 例正常對(duì)照組均為健康體檢者，排除第二腫瘤及其他疾病，其中男5 例，女5 例，年齡39～61 歲，平均年齡(50.40±7.86)歲。一般情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法 20 例新確診的PTCL 患者其中Ⅱ期7 例，Ⅲ期5 例，Ⅳ期8 例，均采用標(biāo)準(zhǔn)CHOP 方案化療:環(huán)磷酰胺750 mg/m2d1，表柔比星75 mg/m2d1，長(zhǎng)春新堿1.4 mg/m2d1，潑尼松60 mg/m2d 1 -5，21 d 為1 個(gè)療程。第1 療程結(jié)束后病情穩(wěn)定者繼續(xù)給予CHOP 方案化療，化療周期數(shù)為4 個(gè)周期，并于第1 療程前及第4 療程結(jié)束后分別抽取外周肝素抗凝血。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 取PTCL 患者化療前后與正常對(duì)照組外周肝素抗凝血，每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)2 管，均取標(biāo)本100 μl，一管加入抗 CD4-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-PEcy5 單克隆抗體標(biāo)記各20 μl，另一管加入CD8-FITC、CD45RA-PE、CD45RO-PEcy5 單克隆抗體標(biāo)記各20 μl，同型對(duì)照分別為IgG1-FITC，IgG1-PE，IgG1-PEcy5，混勻，避光孵育25～30 min。加入紅細(xì)胞裂解液2 ml 混勻，室溫避光孵育15 min，直至液體澄清透明，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。加入2 ml PBS 洗滌液混勻，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。將細(xì)胞懸浮于0.5 ml PBS 洗滌液中，振蕩混勻后上機(jī)檢測(cè)。Beckman 公司EPICS-XL型流式細(xì)胞儀獲取樣本，CellQuest 軟件進(jìn)行分析。

1.4 療效評(píng)價(jià) 根據(jù)WHO 實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)將治療效果分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD)。四療程治療結(jié)束后進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，化療客觀有效定義為CR +PR，化療無效定義為SD +PD。毒性反應(yīng)按WHO 化療藥物毒性反應(yīng)分度標(biāo)準(zhǔn)分為0～Ⅳ度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)算各組均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差，用±s 表示，兩組均數(shù)采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組均數(shù)采用單因素方差分析及LSD 兩兩比較，以P ＜0.05 為差異有顯著性的界限。

2 結(jié)果

2.1 療效及不良反應(yīng)分析 CHOP 方案治療20 例PTCL 患者近期療效分析，完全緩解(CR)6 例、部分緩解(PR)9 例、穩(wěn)定(SD)1 例、進(jìn)展(PD)4 例。客觀有效率為75%，化療無效率為25%。毒性反應(yīng):Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制7 例，Ⅳ度骨髓抑制2 例;Ⅰ度胃腸道反應(yīng)2 例，輕度肝功能損害4 例，合并肺部感染1 例。

2.2 PTCL 患者化療前后外周血中初始T 細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞的比較 PTCL 患者化療前外周血中CD4+T 細(xì)胞明顯低于正常對(duì)照組，而CD8+T 細(xì)胞明顯升高，CD4+/CD8+明顯降低。治療后外周血中CD4+T 細(xì)胞仍低于正常對(duì)照組，但較治療前明顯升高，而治療后CD8+T 細(xì)胞則較治療前下降，CD4+/CD8+稍升高(圖1)。進(jìn)一步分析CD45RA+和CD45RO+T 細(xì)胞在兩個(gè)亞群的比例情況，發(fā)現(xiàn)CD4+CD45RO+細(xì)胞治療前明顯降低，治療后稍升高，而CD4+CD45RA+細(xì)胞治療前明顯升高，治療后則下降，而CD8+CD45RO+細(xì)胞、CD8+CD45RA+治療前明顯升高，治療后稍降低(圖2)。

2.3 療效與患者外周血T 淋巴細(xì)胞亞群關(guān)系 將20 例PTCL 患者按療效分為化療有效組和無效組，兩組治療前后外周血CD4+表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而治療前后有效組的初始T 細(xì)胞(CD4+CD45RA+)均明顯高于無效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，記憶T 細(xì)胞(CD4+CD45RO+)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖1 PTCL 組、治療后組與對(duì)照組外周血CD4 +和CD8 +T 細(xì)胞亞群比較(%)Fig.1 Comparison of CD4 + and CD8 + T cells subgroup in peripheral blood between PTCL group，after cure group and control group(%)

圖2 PTCL 組、治療后組與對(duì)照組外周血CD4 +和CD8 +T 細(xì)胞中CD45RA + 和CD45RO + T 細(xì)胞分布情況(%)Fig.2 CD45RA + and CD45RO + cells distribution of CD4 + and CD8 + T cells in peripheral blood between PTCL group，after cure group and control group(%)

圖3 化療有效組與無效組CD4 + CD45RA + 和CD4 +CD45RO +T 細(xì)胞的比較(%)Fig.3 CD45RA + and CD45RO + cells distribution of CD4 + T cells in chemotherapy response group and no response group(%)

3 討論

外周T 細(xì)胞淋巴瘤在中國(guó)等亞洲國(guó)家較多見，約占整個(gè)淋巴瘤發(fā)病的20%～30%［3，4］。其病因尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)與免疫缺陷、病毒感染、基因突變等有關(guān)。與B 細(xì)胞淋巴瘤相比，外周T 細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病時(shí)多處于中晚期，侵襲性較強(qiáng)，常有皮膚、肝脾、骨髓的侵犯。CHOP 方案常用于外周T 細(xì)胞淋巴瘤的一線治療，但緩解期短，復(fù)發(fā)快，預(yù)后不良，遠(yuǎn)期生存率低［5］。最近報(bào)道含蒽環(huán)類藥物的化療方案沒有提高總生存率［6］，而其他新的聯(lián)合化療方案，如CMED 方案、EPOCH 方案［7］，尚未得到廣泛的公認(rèn)。而免疫靶向治療可能是未來臨床研究的方向，但研究的前提需了解機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

機(jī)體的抗腫瘤免疫以T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，細(xì)胞免疫功能缺陷，可能是腫瘤形成的原因之一。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PTCL 患者外周血中CD4+CD45RA+T 細(xì)胞明顯增加，而CD4+CD45RO+T 細(xì)胞比例明顯降低，考慮PTCL 胸腺近期輸出功能仍較強(qiáng)。為了進(jìn)一步了解化療后PTCL 患者體內(nèi)初始T 細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞的變化，我們對(duì)20 例PTCL 患者進(jìn)行四周期CHOP 方案化療，結(jié)果顯示20 例PTCL 患者化療后15 例腫瘤獲得緩解，5 例出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，化療有效率75%，說明CHOP 方案近期療效尚可。通過檢測(cè)T 細(xì)胞亞群，我們發(fā)現(xiàn)PTCL 患者治療前外周血中CD4+T 細(xì)胞明顯降低，CD8+T細(xì)胞明顯升高，CD4+/CD8+比例明顯降低，這提示PTCL 患者體內(nèi)T 細(xì)胞亞群的平衡失調(diào)，細(xì)胞免疫功能低下，輔助性T 細(xì)胞的減少降低了機(jī)體對(duì)抗腫瘤的免疫效應(yīng)，CD8+T 細(xì)胞可能受PTCL 相關(guān)抗原刺激增殖，從而使其比例發(fā)生變化。而CHOP 方案治療后CD4+T 細(xì)胞較治療前明顯升高，但仍低于正常對(duì)照組，提示化療雖抑制腫瘤的增殖，使患者輔助性T 細(xì)胞增殖增加，CD8+T 細(xì)胞增殖受減少，機(jī)體免疫應(yīng)答的正調(diào)節(jié)點(diǎn)占優(yōu)勢(shì)，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)，但機(jī)體的免疫功能仍未能完全恢復(fù)至正常，說明即使是化療有效控制腫瘤，但機(jī)體仍存在免疫功能低下。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)PTCL 患者外周血中CD4+CD45RA+T 細(xì)胞明顯增加，而CD4+CD45RO+T 細(xì)胞比例明顯降低，考慮PTCL 胸腺近期輸出功能仍較強(qiáng)。我們進(jìn)一步分析CD45RA+和CD45RO+T 細(xì)胞的比例，同樣發(fā)現(xiàn)PTCL 患者外周血中CD4+CD45RA+和CD4+CD45RO+細(xì)胞的變化特點(diǎn)與我們前期研究結(jié)果相同，也與Yang［8］的研究結(jié)果相似。PTCL 患者治療前初始T 細(xì)胞升高，可能由于腫瘤抗原的刺激，機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答的結(jié)果。而CD4+CD45RO+T 細(xì)胞相對(duì)降低考慮與其他亞群比例增加，尤其是CD8+T 細(xì)胞比例增加相關(guān)。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)CHOP 治療后，CD4+CD45RA+和CD8+CD45RA+T 細(xì)胞，以及CD8+CD45RO+細(xì)胞比例降低，其原因可能有幾個(gè)方面，最主要的是可能是化療對(duì)T 細(xì)胞的直接抑制作用，因此，對(duì)于化療后，胸腺輸出功能的觀察更需要?jiǎng)討B(tài)隨訪不同時(shí)間點(diǎn)CD4+CD45RA+和CD8+CD45RA+T 細(xì)胞的變化特點(diǎn)，有可能得出更全面的結(jié)論，其次，由于治療后腫瘤抗原的刺激減弱，也可能存在初始T 細(xì)胞向記憶T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化增多，使初始T 細(xì)胞下降，記憶T 細(xì)胞升高。

通過分析療效與初始T 細(xì)胞的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)PTCL 患者中化療有效組和化療無效組相比，治療前有效組的初始T 細(xì)胞較無效組明顯增高，化療后，有效組初始T 細(xì)胞雖較前下降但仍明顯高于化療無效患者，而記憶T 細(xì)胞(CD45RO+)的差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果提示病人伴有較強(qiáng)胸腺輸出功能可能是對(duì)治療敏感的一個(gè)有利因素。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，白血病病人T 細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答功能明顯低于正常人，預(yù)后較好的AML 亞型伴有較高的胸腺輸出功能［9，10］，盡管我們從細(xì)胞表型上檢測(cè)到這些CR45RA +T 細(xì)胞變化，仍然有待進(jìn)一步檢測(cè)其活化和效應(yīng)功能，才能更全面地評(píng)價(jià)病人的T 細(xì)胞免疫功能狀態(tài)及治療后免疫功能的變化，同時(shí)，可以根據(jù)病人T 細(xì)胞免疫的這些優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，選擇性的上調(diào)T 細(xì)胞的功能，提高病人抗腫瘤的能力。

綜上所述，本研究首先分析了PTCL 病人化療前后外周血中T 細(xì)胞中CD4+和CD8+T 細(xì)胞中初始T'細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞亞群的變化，發(fā)現(xiàn)治療前病人初始T 細(xì)胞含量較高，提示胸腺輸出功能仍較強(qiáng)，而治療后初始T 細(xì)胞含量明顯降低，化療前患者外周血初始T 細(xì)胞的水平可能與患者的近期化療效果間存在聯(lián)系，通過該細(xì)胞亞群的檢測(cè)，可能幫助我們更好的預(yù)測(cè)化療效果。另外，臨床上可以根據(jù)免疫功能狀態(tài)結(jié)合臨床資料，有針對(duì)性地制定治療方案，這對(duì)患者的生存率，改善患者的生存質(zhì)量都有著積極的意義。

［1］呂學(xué)文，陳煥偉，李揚(yáng)秋.外周T 細(xì)胞淋巴瘤患者外周血CD45RA+T 和CD45RO+T 細(xì)胞分布特點(diǎn)［J］.免疫學(xué)雜志，2013，29(9):819-823.

［2］Swerdlow SH，Campo E，Harris NL，et al.WHO classification of tumours of haemtopoietic and lymphoid tissues［M］.International Agency for Research on Cancer.World Health Organization，2008:306-308.

［3］Xie W，Hu K，Xu F，et al.Clinical analysis and prognostic significance of lymphoma-associated hemophagocytosis in peripheral T celllymphoma［J］.Ann Hematol，2013，92(4):481-486.

［4］Tomita N，Motomura S，Hyo R，et al.Comparison of peripheral Tcell lymphomas and diffuse large B-cell lymphoma［J］.Cancer，2007，109(6):1146-1151.

［5］Xu PP，Wang Y，Shen Y，et al.Prognostic factors of Chinese patients with T/NK-cell lymphoma:a single institution study of 170 patients［J］.Med Oncol，2012，29(3):2176-2182.

［6］Vose J，Armitage J，Weisenburger D.International peripheral T-cell and natural killer/T-cell lymphoma study:pathology findings and clinical outcomes［J］.J Clin Oncol，2008，26(25):4124-4130.

［7］Schmitz N，Trumper L，Ziepert M，et al.Treatment and prognosis of mature T-cell and NK-cell lymphoma:an analysis of patients with T-cell lymphoma treated in studies of the German High-Grade Non-Hodgkin Lymphoma Study Group［J］.Blood，2010，116(18):3418-3425.

［8］Yang W，Jia X，Su Y，et al.Immunophenotypic characterization of CD45RO+and CD45RA+T cell subsets in peripheral blood of peripheral T cell lymphoma patients［J］.Cell Biochem Biophys，2014，70(2):993-997.

［9］Li Y，Yin Q，Yang L，et al.Reduced levels of recent thymic emigrants in acute myeloid leukemia patients［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(7):1047-1055.

［10］Li Y，Geng S，Yin Q，et al.Decreased level of recent thymic emigrants in CD4+and CD8+T cells from CML patients［J］.J Transl Med，2010，14(8):47.