羅俊茜 張 帆 楊曉峰 羅 芳 劉杰昊 龐建智 閆三華 張小雷

(山西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，太原 030001)

膀胱癌(Bladder carcinoma)是最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中75%～85%為淺表性膀胱腫瘤，又稱(chēng)為非肌肉浸潤(rùn)性腫瘤(Non muscle invasive bladder tumor，NMIBC)。雖然采取膀胱癌手術(shù)及術(shù)后綜合療法顯著提高了患者5 年生存率，但因膀胱癌早期血尿?？勺孕袦p輕或停止，易給患者造成“好轉(zhuǎn)”或“治愈”的錯(cuò)覺(jué)而貽誤治療［1-3］。因此，針對(duì)膀胱原位癌診斷困難、術(shù)中腫瘤不易識(shí)別和術(shù)后需膀胱鏡復(fù)查的臨床問(wèn)題，積極尋找特異性強(qiáng)、陽(yáng)性率高、能識(shí)別微小腫瘤的腫瘤標(biāo)志物將是改變膀胱癌診療現(xiàn)狀的有效手段之一。

噬菌體展示技術(shù)于1985 年由Smith 等［4］首次創(chuàng)造性地提出，現(xiàn)已成為發(fā)現(xiàn)新功能多肽和改變已有多肽性質(zhì)的有效工具，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程和細(xì)胞生物學(xué)。其原理為通過(guò)將一定的外源蛋白質(zhì)或多肽的基因表達(dá)產(chǎn)物融合到噬菌體衣殼蛋白PⅢ或PⅧ端，并在噬菌體顆粒表面展示該基因編碼的蛋白，同時(shí)將遺傳密碼信息整合到個(gè)體噬菌體的基因組中，從而在基因與蛋白質(zhì)或多肽間建立直接聯(lián)系［5］。1996 年，Pasqualini 等［6］在噬菌體展示技術(shù)體外篩選的基礎(chǔ)上，發(fā)展了體內(nèi)篩選方法。噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選方法將噬菌體展示技術(shù)施以體內(nèi)選擇壓力，進(jìn)行腫瘤組織或其內(nèi)部血管特異性配體的篩選，從而能夠獲得具有靶向作用的噬菌體表面展示的小分子多肽序列。因此，為實(shí)現(xiàn)膀胱癌微小腫瘤的分子診斷和靶向治療，本研究以人膀胱癌細(xì)胞BIU87 為研究對(duì)象，采用體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選人膀胱癌的特異性靶向多肽標(biāo)志物，為膀胱癌早期診斷和靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)試劑盒(Ph.D.-C7CTMPeptide Library Kit)購(gòu)自NEW ENGLAND BioLabs，包括噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)(～1 ×1013pfu/ml);宿主菌E.coli ER2738;-96 gⅢ測(cè)序引物5'-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'。SPF級(jí)BALB/c 雄性裸鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，3～4 周齡，體重15～18 g。人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87 購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所。人膀胱正常移行上皮細(xì)胞iMBT 購(gòu)自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。M13 噬菌體單鏈基因組DNA 快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。HRP/Anti-M13 單克隆抗體購(gòu)自GE Healthcare。Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自BD 公司。兔抗M13 噬菌體抗體、羊抗兔-HRP 標(biāo)記二抗購(gòu)自Sigma。IPTG、Xgal、PEG-8000 等其余試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，并按照噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 荷瘤鼠模型制備 人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞BIU87 用含有10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)生長(zhǎng)至95%后，用0.25%胰蛋白酶收獲細(xì)胞并4℃條件下懸浮于200 μl Matrigel 基質(zhì)膠中，將BIU87 細(xì)胞(1 ×107細(xì)胞/側(cè))注射于裸鼠雙側(cè)背部皮下，每天觀察并記錄腫塊直徑。

1.2.2 噬菌體展示肽庫(kù)體內(nèi)篩選 2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉荷瘤裸鼠，尾靜脈注射噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)(約1 ×1010pfu)，體內(nèi)循環(huán)15 min 后，心臟灌注0.9%生理鹽水至裸鼠實(shí)質(zhì)性臟器發(fā)白，處死裸鼠，取腫瘤及對(duì)照組織，各取部分置于4%多聚甲醛固定，其余組織剪碎，TBS 洗滌3 次，0.1 mol/L Glycine(pH2.2)洗脫10 min，1 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)中和，再用0.1%Trition X-100 作用2 h 以裂解細(xì)胞釋放內(nèi)化部分噬菌體，回收洗脫產(chǎn)物保存。取10 μl 測(cè)滴度，并另取10 μl 擴(kuò)增，用于下一輪篩選。每輪篩選前后用LB/IPTG/Xgal 瓊脂平板測(cè)定噬菌體滴度。經(jīng)過(guò)3 輪體內(nèi)篩選后，隨機(jī)挑取30 個(gè)藍(lán)色單克隆噬菌體斑制備原種用于鑒定。

1.2.3 免疫組織化學(xué)鑒定噬菌體肽庫(kù)體內(nèi)分布 將上述各組織經(jīng)4%多聚甲醛固定過(guò)夜，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，60℃恒溫烘烤后脫蠟至水，3%H2O2-甲醇(1∶9)于37℃孵育0.5 h，微波抗原修復(fù)，5%BSA 濕盒封閉0.5 h，滴加兔抗M13 噬菌體抗體(1∶200)于4℃過(guò)夜，次日滴加羊抗兔-HRP 標(biāo)記二抗(1∶50)37℃孵育0.5 h，DAB 顯色后蘇木素復(fù)染，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，待切片干燥后用Scanscope 組織病理切片掃描儀掃描、分析。

1.2.4 ELISA 初步鑒定單克隆噬菌體 將人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87 及人膀胱正常移行上皮細(xì)胞iMBT 以密度1 ×104個(gè)/孔間隔接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁、長(zhǎng)滿單層后無(wú)血清RPMI1640 處理1 h，4%多聚甲醛固定后滴加3%過(guò)氧化氫于37℃培養(yǎng)箱孵育0.5 h，5%PBS-BSA 封閉1 h 后，加入1×1010pfu/孔單克隆噬菌體4℃條件過(guò)夜，每個(gè)單克隆噬菌體孵育BIU87 及iMBT 各3 孔，次日加入HRP/Anti-M13 單克隆液(1 ∶5 000)，TMB 顯色及HCl 終止，酶標(biāo)分析儀檢測(cè)450 nm 處OD 值。以體外第一輪洗脫得到的未結(jié)合噬菌體為陰性對(duì)照，PBS 為空白對(duì)照。計(jì)算公式為:親和力=［BIU87(OD450nm 克隆-OD450nm 陰性對(duì)照克隆)］/［iMBT(OD450nm 克隆-OD450nm 陰性對(duì)照克隆)］，親和力≥2 為陽(yáng)性克隆。

1.2.5 測(cè)序及序列分析 參照《分子克隆》第3 版及M13 噬菌體單鏈基因組DNA 快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取單克隆噬菌體單鏈DNA，送華大基因(BGI)測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出多肽氨基酸序列，并使用NCBI/BLAST、SwissProt 進(jìn)行分析。

1.2.6 多肽的合成 根據(jù)ELISA 鑒定及測(cè)序分析結(jié)果，選擇克隆重復(fù)率高表達(dá)的多肽序列NYZL1，由杭州中肽生化有限公司合成FITC 標(biāo)記多肽(FITC-C6-NYZL1)。

1.2.7 激光掃描共聚焦顯微鏡術(shù)鑒定FITC 標(biāo)記多肽 BIU87 細(xì)胞以1 ×105個(gè)/孔接種于培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至40%左右，4%多聚甲醛固定細(xì)胞后加FITC-C6-NYZL1 共同孵育過(guò)夜，次日加DAPI復(fù)染，封片后共聚焦顯微鏡下觀察采集圖片。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)鑒定FITC 標(biāo)記多肽 BIU87 細(xì)胞以1 ×106個(gè)/ml 懸浮于離心管，避光條件下加FITC-C6-NYZL1 孵育3 h，PBS 作為空白對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 異體移植BIU87 細(xì)胞荷瘤裸鼠模型的建立 致瘤1 周后即可長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的腫瘤，逐日觀察記錄腫塊直徑，待直徑達(dá)2 cm 左右觸之質(zhì)硬，活動(dòng)度較好，無(wú)化膿破潰即用于篩選，出瘤率達(dá)100%(圖略)。腫瘤組織HE 染色鏡下可見(jiàn)細(xì)胞彌散狀分布，大小較均一，細(xì)胞核大深染，呈圓形，核仁明顯并可見(jiàn)核分裂象，胞漿豐富(圖1)。

2.2 噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)體內(nèi)富集 將Ph.D.C7C 肽庫(kù)尾靜脈注射入荷瘤裸鼠，經(jīng)過(guò)3 輪體內(nèi)親和篩選并洗脫后進(jìn)行噬菌體滴度測(cè)定，結(jié)果顯示，隨著每一輪篩選，噬菌體回收率不斷提高，到第3輪篩選結(jié)束時(shí)，噬菌體從腫瘤組織的回收率是第1 輪的4.334 ×102倍，富集效果明顯(表1)。

圖1 荷瘤裸鼠腫瘤組織HE 染色(×200)Fig.1 HE staining of nude mice tumor tissue(×200)

2.3 噬菌體肽庫(kù)在腫瘤組織的富集 每一輪體內(nèi)篩選過(guò)程中，取腫瘤及對(duì)照組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，每張切片(×200)隨機(jī)選取上、下、左、右、中視野觀察，利用Image Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)分析噬菌體多肽與腫瘤及對(duì)照組織的結(jié)合情況，結(jié)果如圖2 顯示，腫瘤組織中富集的噬菌體肽庫(kù)隨著每一輪體內(nèi)篩選進(jìn)行而增加，同時(shí)肝臟與腎臟組織因血管豐富、代謝速度快，均可非特異大量吸附文庫(kù)噬菌體，而肺與肌肉組織只有少量噬菌體肽庫(kù)結(jié)合。

2.4 膀胱癌細(xì)胞與陽(yáng)性噬菌體克隆的富集 經(jīng)過(guò)3輪體內(nèi)篩選后，隨機(jī)挑取30個(gè)藍(lán)色單克隆噬菌體斑，利用ELISA 初步鑒定單克隆噬菌體對(duì)BIU87 親和力，檢測(cè)每孔OD450nm 并計(jì)算，結(jié)果顯示親和力≥2 的陽(yáng)性單克隆噬菌體共有24 個(gè)，其中R2、R6、R8、R11、R12、R13、R14、R15、R17、R30 單克隆噬菌體親和力≥6，對(duì)BIU87 親和力強(qiáng)，為強(qiáng)陽(yáng)性克隆(圖3)。

表1 噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)體內(nèi)篩選噬菌體克隆富集Tab.1 Enrichment rate of phage screening in vivo

圖2 免疫組化鑒定噬菌體肽庫(kù)體內(nèi)分布Fig.2 Immunohistochemical identified distribution of phage peptide libraries in vivo

圖3 單克隆噬菌體親和力Fig.3 ELISA identified phage clones affinity

圖4 激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-C6-NYZL1 對(duì)BIU87結(jié)合特異性Fig.4 Confocal laser scanning microscope identified specificity of FITC-C6-NYZL1

2.5 膀胱癌細(xì)胞特異結(jié)合噬菌體的測(cè)序 將ELISA 初步鑒定后親和力高的10 個(gè)噬菌體藍(lán)斑進(jìn)行擴(kuò)增并提取DNA 測(cè)序，獲得多肽序列，其中重復(fù)率最高的多肽序列為噬菌體R2、R6、R8、R11、R13、R14、R15、R30 序列CSSPIGRHC(8/10)，其次為R12序列CTMSNLKGC(1/10)、R17 序列CNNVLSQMC(1/10)。序列CSSPIGRHC 命名為NYZL1，運(yùn)用NCBI/BLAST、SwissProt 等數(shù)據(jù)庫(kù)分析，NYZL1 與已知基因和蛋白無(wú)同源性，且國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均未見(jiàn)報(bào)道。

2.6 化學(xué)合成FITC 標(biāo)記多肽 多肽NYZL1 通過(guò)二硫鍵連接半胱氨酸耦合成環(huán)，由杭州中肽生化有限公司合成FITC-C6-NYZL1，通過(guò)HPLC 及MS 純化、鑒定該合成肽純度≥98%。

2.7 熒光顯微鏡鑒定FITC 標(biāo)記多肽的特異性 為進(jìn)一步鑒定FITC 標(biāo)記多肽NYZL1 與人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞BIU87 具有親和力和特異性，將FITC-C6-NYZL1 與BIU87 孵育，PBS 作空白對(duì)照，鏡下觀察其結(jié)合情況，結(jié)果表明FITC-C6-NYZL1 在BIU87 細(xì)胞上有高富集熒光亮點(diǎn)，且均勻結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中(圖4)。

表2 FITC-C6-NYZL1 與BIU87 結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度值(±s)Tab.2 Mean fluorescence intensity value of FITC-C6-NYZL1 binding BIU87(±s)

表2 FITC-C6-NYZL1 與BIU87 結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度值(±s)Tab.2 Mean fluorescence intensity value of FITC-C6-NYZL1 binding BIU87(±s)

Note:1)Statistically significant difference(P ＜0.01).Independent samples T-test.

2.8 流式細(xì)胞術(shù)鑒定FITC 標(biāo)記多肽的特異性 將FITC-C6-NYZL1 與BIU87 細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀觀察，結(jié)果顯示FITC-C6-NYZL1 與BIU87 結(jié)合的熒光強(qiáng)度值為53.1925，PBS 空白對(duì)照熒光強(qiáng)度值為6.67，P ＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

3 討論

噬菌體展示作為一項(xiàng)選擇技術(shù)，將大量的外源性隨機(jī)多肽或蛋白與噬菌體病毒顆粒的DNA 編碼序列間建立了直接聯(lián)系，通過(guò)對(duì)隨機(jī)多肽文庫(kù)的篩選，分離出對(duì)靶細(xì)胞具有親和力或特異性改變的變異株。目前，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選已得到針對(duì)不同腫瘤組織或血管的特異性靶向多肽配體，這些靶向多肽配體可顯示腫瘤組織或血管，或利用特異靶向多肽配體阻斷生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合，或攜帶細(xì)胞毒性藥物攻擊腫瘤組織，從而用于腫瘤診斷和治療［7-9］。Lee 等［10］通過(guò)T7 噬菌體展示肽庫(kù)篩選出人膀胱癌HT-1367 細(xì)胞系特異性導(dǎo)向肽CSNRDARRC，并證實(shí)該肽對(duì)膀胱癌患者的尿液及病理組織有一定的結(jié)合特異性。趙揚(yáng)等［11-13］證明FITC 標(biāo)記肽CSNRDARRC 可與膀胱癌T24 細(xì)胞系及人膀胱癌患者病理組織相結(jié)合，但結(jié)合特異性有待提高。本實(shí)驗(yàn)利用噬菌體展示技術(shù)，以我國(guó)第一株自建人膀胱癌細(xì)胞BIU87［14］為靶細(xì)胞，旨在快速、高效的篩選出與人膀胱癌BIU87 細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體克隆，從而獲得能與人膀胱癌靶向結(jié)合的氨基酸序列。相比體外培養(yǎng)的細(xì)胞，裸鼠移植瘤模型有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于模擬人體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制等研究［15］。本實(shí)驗(yàn)采用荷瘤動(dòng)物模型進(jìn)行完全體內(nèi)篩選，最大限度的模擬膀胱癌組織中的實(shí)際內(nèi)環(huán)境，借助自身組織、器官為對(duì)照，豐富了篩選靶蛋白的范圍，同時(shí)采用活體心臟灌注生理鹽水盡可能地減少體內(nèi)非特異性噬菌體的殘留，提高篩選的特異性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)三輪體內(nèi)篩選得到了一組對(duì)膀胱腫瘤特異性靶向能力的噬菌體克隆，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、ELISA 及DNA 測(cè)序分析初步鑒定噬菌體R2、R6、R8、R11、R13、R14、R15、R30 與人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87 有較強(qiáng)親和力和特異性。對(duì)以上噬菌體克隆外源多肽進(jìn)行生物信息學(xué)分析，序列由Ser、Pro、Ile、Gly、Arg、His 六種氨基酸組成，兩端以Cys 通過(guò)二硫鍵連接成為構(gòu)象穩(wěn)定的小分子多肽，該序列與NCBI/BLAST、SwissProt 等數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因和蛋白無(wú)同源性，且國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)多肽NYZL1 對(duì)膀胱癌細(xì)胞的特異性，顯示人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系BIU87 表面有多肽NYZL1 的特異性結(jié)合位點(diǎn)。多肽NYZL1 可能成為膀胱癌相關(guān)抗原的新配體，為膀胱癌早期診斷和靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

目前，我們只在體外通過(guò)細(xì)胞和組織水平驗(yàn)證了多肽NYZL1 對(duì)BIU87 的特異性，尚需繼續(xù)在整體動(dòng)物水平上通過(guò)FITC-C6-NYZL1 活體示蹤驗(yàn)證其特異性，以證實(shí)多肽NYZL1 是否在體內(nèi)具有腫瘤靶向性。

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