張洪長 劉明昕 張 瑩 王恩鵬 陳 港 姜鴻遠

(長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心藥理研究室，長春 130117)

RA 是一種病因未明的以慢性、對稱性、多關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞為主要特征的自身免疫性疾?。?］。隨著免疫遺傳學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)固有免疫在RA 發(fā)病和病情進展中具有重要作用［2］。TOLL樣受體(Toll-like receptor TLR)信號傳導(dǎo)通路為介導(dǎo)固有免疫的經(jīng)典通路［3］，MyD88 是TLR 信號通路上最重要的接頭蛋白，多數(shù)TLR 均可通過MyD88 激活TRAF-6，TRAF-6 被磷酸纖維素化后，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β 活化激酶1(TAK1)激活下游的NF-κB 信號通路，誘導(dǎo)促炎癥細胞因子的表達［4］。如TRAF-6缺失可以造成TLR 信號缺陷，抑制NF-κB 活化，減少炎性細胞因子產(chǎn)生［5］。炎性細胞釋放促炎癥因子和趨化因子的誘導(dǎo)降解酶，并誘導(dǎo)破骨細胞激活，從而導(dǎo)致骨與軟骨的破壞［6］。SIN 是從傳統(tǒng)中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體，具有免疫抑制、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用［7］。SIN 抑制RA-FLS 細胞內(nèi)MyD88 和TRAF-6 表達的研究，目前國內(nèi)外還少有相關(guān)報道。本實驗利用SIN 處置RA-FLS 細胞，闡明SIN 能夠有效地抑制RA-FLS 細胞內(nèi)MyD88 和TRAF-6 基因、蛋白表達，這或為SIN 抑制RA-FLS細胞增生導(dǎo)致患者軟骨和軟骨下骨破壞造成關(guān)節(jié)畸形和強直發(fā)生的重要分子機制之一。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 FLS 取自RA 患者(臨床診斷符合2009 年美國風(fēng)濕病學(xué)會標(biāo)準(zhǔn))近兩年手足關(guān)節(jié)微創(chuàng)手術(shù)關(guān)節(jié)囊廢棄物(符合倫理要求的實驗用標(biāo)本)，由吉林大學(xué)附屬醫(yī)院骨科提供。青藤堿(＞98%純度)購自成都克洛瑪生物科技有限公司;胎牛血清購自美國Thermo 公司;DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司;堿性磷酸酶(ALP)、CCK-8 細胞增殖-毒性檢測試劑盒，RNA-OUT 總RNA 提取試劑盒，總蛋白定量測試盒(BCA 法)，RIPA 細胞裂解液，均購自南京建成生物工程研究所;兔抗人MyD88、TRAF-6，小鼠抗人β-actin 單克隆抗體，購自美國Santa Cruz 公司;羊抗兔二抗購自Bioworld Technology 公司;CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO 公司)，550 型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad 公司);ABI7500PCR 擴增儀:德國Biometra 產(chǎn)品;垂直板電泳裝置:美國Bio-Rad，Mini-ProteinⅢ;DYY40B 型轉(zhuǎn)印電泳槽:北京六一儀器廠產(chǎn)品;Chemi Imager5500 凝膠電泳成像分析系統(tǒng):美國Alphainno-tech Chemi Imager產(chǎn)品。

1.2 青藤堿溶液的配制 用電子天平稱取青藤堿原粉(青藤堿的分子量為401.44 g/mol)，溶解于DMEM 培養(yǎng)液中，配制成1 mol/L 濃度的試驗用液10 ml，無菌條件下，0.22 μm 微孔濾膜過濾后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RA-FLS 細胞的原代培養(yǎng) 取RA 患者手足關(guān)節(jié)微創(chuàng)手術(shù)關(guān)節(jié)囊組織若干小塊，在含20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液浸潤下，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中，進行原代細胞培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況，每2～3 d 換液1 次。觀察細胞爬出情況，待細胞鋪滿瓶底約90% 時，用0.25% 胰蛋白酶采用消化法對細胞進行傳代。將培養(yǎng)基更換為含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，每2 d 換液1 次，取第3 代細胞進行實驗。

1.4 細胞分組及給藥 取對數(shù)生長RA-FLS 細胞隨機分為對照組:連續(xù)用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng);給藥組:含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液加SIN 培養(yǎng)后進行檢測。

1.5 ALP 活性檢測 ATP 是自然界中各種生命活動中共用的能量載體，與生物體內(nèi)多種酶促反應(yīng)，維持正常的生命活動，是活細胞新陳代謝的一個指標(biāo)。通過檢測ATP 含量，可以檢測出細胞的數(shù)量及細胞狀態(tài)，也可檢測細胞的增殖情況。細胞以1 ×104ml-1的密度接種于96 孔板，待其鋪滿孔底后，更換為SIN 培養(yǎng)基;給藥組分別加入終濃度為0.125、0.25、0.5 和1 mmol/L 的SIN，對照組只加培養(yǎng)液，每2 d 換SIN 培養(yǎng)液1 次，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d，棄培養(yǎng)液，采用ALP 試劑盒測定細胞的ALP 活性，將ALP 活性最低者確定為SIN 的最佳濃度，后續(xù)實驗皆采用此濃度。

1.6 CCK-8 法檢測細胞增殖率 選擇生長良好的第3 代RA-FLS 細胞，以1 ×104ml-1的密度接種于96 孔板中，每孔100 μl，對照組及0.5 mmol/L SIN組各5 孔，共60 孔，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中，貼壁后每隔24 h 各取5 孔測定細胞增殖情況。檢測時吸出培養(yǎng)基，每孔加入不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液100 μl 及10 μl CCK-8，CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm 波長下的吸光度(A)值，換算為細胞增殖率。

1.7 熒光定量PCR RA-FLS 細胞及經(jīng)0.5 mmol/L SIN 處置的RA-FLS 細胞，以1 ×105ml-1的密度，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d 后回收，用RNA-OUT 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR 方法測定MyD88 和TRAF-6 mRNA 的表達，以GAPDH 為內(nèi)參。PCR 反應(yīng)條件:94℃變性5 min(94℃，30 s;60℃，30 s;72℃，30 s)× 55 個循環(huán)，72℃延伸5 min。引物從Gene Bank獲得，并用Prime 5.0 軟件設(shè)計，由大連寶生物工程有限公司合成。MyD88 上游引物:5'-ATA GGC ACC AGC ATG CAC-3'，下游引物:5'-TAG GGT CCT TAC CAG GTA-3'，擴增產(chǎn)物長度為181 bp;TRAF-6上游引物:5'-AGC CAC AAT CCC ATG-3'，下游引物:5'-GTC ACG GAA AGG CGC-3'，擴增產(chǎn)物長度為224 bp;GAPDH 上游引物:5'-CTC ATG ACC ACA GTC CAT GC-3'，下游引物:5'-CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC-3'，擴增產(chǎn)物長度為201 bp。由計算機自動計算得出CT 值，根據(jù)所得CT 值應(yīng)用2-△△CT法 計 算MyD88 和TRAF-6 mRNA 相 對 表達量。

1.8 Western blot 分析 RA-FLS 細胞及經(jīng)0.5 mmol/L SIN 處置的RA-FLS 細胞，以1 ×105ml-1的密度，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d 后，PBS 漂洗2 次，加入細胞裂解液RIPA，冰上靜置15 min 后收集裂解液，-20℃保存?zhèn)溆谩⑸鲜隽呀猱a(chǎn)物反復(fù)凍融裂解3 次，12 000 r/min 離心30 min，按照BCA-200 蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，取60 μg 蛋白經(jīng)SDSPAGE 凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上用封閉液封閉后，分別加入1∶200 兔抗人MyD88 和TRAF-6 一抗，4℃封閉過夜，TBST 洗滌3 次，每次15 min，加入過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，置室溫避光2 h 顯色，比較特定蛋白條帶吸光度值。同時檢測β-actin 蛋白含量作為特定蛋白表達強弱的指標(biāo)。蛋白表達水平=特定蛋白灰度值/β-actin 蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，細胞ALP 活性、細胞增殖、MyD88 和TRAF-6 蛋白表達水平以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 SIN 處置RA-FLS 細胞ALP 活性 加藥濃度為0.125、0.25、0.5 和1 mmol/L 的SIN 各組，對RA-FLS 細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d 后，檢測各組的ALP 活性均低于對照組，分別為3.286±0.180、3.102±0.127、2.716±0.097 和2.94±0.126，其中濃度為0.5 mmol/L 的SIN 組ALP 活性最低，與對照組活性(3.875±0.106)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，故后續(xù)實驗皆采用此濃度。

2.2 SIN 作用不同時間RA-FLS 細胞增殖率 RAFLS 細胞及經(jīng)0.5 mmol/L SIN 處置的RA-FLS 細胞，用CCK-8 法檢測細胞增殖，結(jié)果顯示:與對照組細胞比較，0.5 mmol/L SIN 組處置細胞的生長明顯受到抑制，貼壁后24 h 即出現(xiàn)了生長速度的差異，此后出現(xiàn)明顯的生長差異，到第4 天時，對照組及SIN 組RA-FLS 細胞的增殖均達到高峰，進入平臺期，見表1。

2.3 熒光定量PCR 檢測MyD88 和TRAF-6 mRNA的表達 細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d 后，SIN 對MyD88 和TRAF-6 mRNA 表達的影響與對照組比較，SIN 組MyD88 和 TRAF-6 mRNA 表達明顯降低(P ＜0.01)，見表2。

2.4 Western blot 法檢測MyD88 和TRAF-6 蛋白表達 細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d 后，經(jīng)Western blot 檢測，對照組中大量表達 MyD88 和 TRAF-6 蛋白，但0.5 mmol/LSIN給藥組中MyD88和TRAF-6的蛋白表達明顯降低，經(jīng)灰度分析顯示:對照組的MyD88 和TRAF-6 蛋白表達水平顯著高于0.5 mmol/L SIN 給藥組(P ＜0.01)，見表3 和圖1。

表1 對照組和SIN 組RA-FLS 細胞增殖率(n=6，±s，η/%)Tab.1 Proliferation rates of fibroblast-like synoviocytes in control group and SIN group(n=6，±s，η/%)

表1 對照組和SIN 組RA-FLS 細胞增殖率(n=6，±s，η/%)Tab.1 Proliferation rates of fibroblast-like synoviocytes in control group and SIN group(n=6，±s，η/%)

Note:1)P ＜0.01 vs control group.

表2 對照組和SIN 組RA-FLS 細胞中MyD88 和TRAF-6 mRNA 的表達(n=6，±s)Tab.2 Expressions of MyD88 and TRAF-6 mRNA in fibroblast-like synoviocytes in SIN group and control group(n=6，±s)

表2 對照組和SIN 組RA-FLS 細胞中MyD88 和TRAF-6 mRNA 的表達(n=6，±s)Tab.2 Expressions of MyD88 and TRAF-6 mRNA in fibroblast-like synoviocytes in SIN group and control group(n=6，±s)

Note:1)P ＜0.01 vs control group.

表3 SIN 組和對照組RA-FLS 細胞中MyD88 和TRAF-6蛋白表達水平(n=6，±s)Tab.3 Expressions levels of MyD88 and TRAF-6 proteins in fibroblast-like synoviocytes in SIN group and control group(n=6，±s)

表3 SIN 組和對照組RA-FLS 細胞中MyD88 和TRAF-6蛋白表達水平(n=6，±s)Tab.3 Expressions levels of MyD88 and TRAF-6 proteins in fibroblast-like synoviocytes in SIN group and control group(n=6，±s)

Note:1)P ＜0.01 vs control group.

圖1 SIN 組和對照組RA-FLS 細胞中MyD88 和TRAF-6蛋白表達Fig.1 Expressions of MyD88 and TRAF-6 proteins of fibroblast-like synoviocytes in SIN group and control group

3 討論

RA 是以對稱性關(guān)節(jié)炎為特征的全身性自身免疫系統(tǒng)疾病，其患病率居自身免疫型結(jié)締組織病中首位。其病理過程中，滑膜細胞增殖、炎癥反應(yīng)繼而侵襲軟骨與骨組織，造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、強直和功能喪失［8，9］。以往的研究已揭示多種炎性細胞因子參與炎癥反應(yīng)，新近研究主要集中在這些炎性因子的作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［10，11］;近年來TLR 信號傳導(dǎo)通路與自身免疫性疾病的研究成為熱點，MyD88、TRAF-6 是該通路中重要的接頭蛋白。MyD88 與IL-1R 相關(guān)激酶(IRAK)相互作用，參與催化IRAK 磷酸化，IRAK 脫離MyD88 與TRAF-6 結(jié)合，TRAF-6 活化后可刺激促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路活化NF-κB，導(dǎo)致多種前炎性因子的轉(zhuǎn)錄、分泌，從而造成滑膜炎癥、軟骨及骨破壞［12，13］。研究證實TLR 信號傳導(dǎo)通路中的MyD88 基因缺陷，動物的關(guān)節(jié)滑膜炎癥和骨組織的破壞明顯減輕［14］。基于TLR 信號途徑中MyD88 與前炎性因子轉(zhuǎn)錄的密切關(guān)系，MyD88 在RA 進展過程中發(fā)揮重要作用，在此信號傳導(dǎo)通路中，TRAF-6的激活可以促進炎性因子的表達，從而導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情的不斷惡化進展，如TRAF-6 缺失可以造成TLR 信號缺陷，抑制NF-κB 活化，減少炎性細胞因子產(chǎn)生。SIN 具有免疫抑制、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用。在細胞因子水平，SIN 可通過抑制滑膜內(nèi)襯巨噬細胞樣細胞TNF-α 合成而阻斷RA 滑膜炎的發(fā)展［15］;有效抑制Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜巨噬A 型細胞增生，纖維組織增生，減少滑膜細胞IL-6 mRNA 表達［16］;下調(diào)人外周血單個核細胞IL-1β、IL-8 mRNA 表達［17］;降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清及關(guān)節(jié)浸液內(nèi)IL-4 及IL-10 水平，從而增強細胞因子的抗炎效應(yīng)［18］。本研究以SIN 對體外培養(yǎng)的RA-FLS 細胞進行干預(yù)，檢測細胞內(nèi)MyD88 和TRAF-6 基因、蛋白表達。研究結(jié)果顯示，使用0.5 mmol/L SIN 干預(yù)的RA-FLS 細胞與對照組比較，MyD88 和TRAF-6 基因、蛋白的表達受到明顯抑制，從而延緩RA-FLS 細胞增生導(dǎo)致患者軟骨和軟骨下骨破壞造成關(guān)節(jié)畸形和強直的發(fā)生，為青藤堿的進一步研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

［1］Sandoo A，Veldhuijzen van Zanten JJ，Metsios GS，et al.Vascular function and morphology in rheumatoid arthritis:a systematic review［J］.Rheumatology(Oxford)，2011，50(11):2125-2139.

［2］Hoffinann JA，Kaaftos FC，Janeway CA，et al.Phylogenetie perspectives in innate iminunity［J］.Science，1999，284(5518):1313-1318.

［3］Kaisho T，Akira S.Toll-like receptor function and signaling［J］.J Allergy Clin Immunol，2006，117(5):979-987.

［4］Huang Y，Cai B，Xu M，et al.Gene silencing of Toll-like receptor2 inhibits proliferation of human liver cancer cells and secretion of inflammatory cytokines［J］.PloS One，2012，7(7):e38890.

［5］Potter C，Eyre S，Cope A，et al.Investigation of association between the TRAF family genes and RA susceptibility［J］.Ann Rheum Dis，2007，66(10):1322-1326.

［6］Shiozawa S，Tsumiyama K，Yoshida K，et al.Pathogenesis of joint destruction in rheumatoid arthritis［J］.Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2011，59(2):89-95.

［7］Wang Q，Li XK.Immunosuppressive and anti-inflammatory activities of sinomenine［J］.Int Immunopharmacol，2011，11 (3):373-376.

［8］Feldmann M，Brennan FM，Maini RN.Rheumatoid arthritis［J］.Cell，1996，85(3):307-310.

［9］Szekanecz Z，Besenyei T，Paragh Q，et al.Angiogenesis in rheumatoid arthritis［J］.Autoimmunity，2009，42(7):563-573.

［10］Matsxmo H，Yudoh K，Katayama R，et al.The role of TNF-alpha in the pathogenesis of inflammation and joint destruction in rheumatoid arthritis(RA):a study using a human RA/SCID mouse chimera［J］.Rheumatology(Oxford)，2002，41(3):329-337.

［11］Walker JG，Ahem MJ，Coleman M，et al.Expression of Jak3，STAT1，STAT4，and STAT6 in inflammatory arthritis:unique Jak3 and STAT4 expression in dendritic cells in seropositive rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2006，65(2):149-156.

［12］Loiarro M，Gallo G，Desantis R，et al.Identification of critical residues of the MyD88 death domain involved in the recruitment of downstream kinases［J］.J Biol Chem，2009，284 (41):28093-28103.

［13］Wesche H，Henzel WJ，Shillinglaw W，et al.MyD88:an adapter that recruits IRAK to the IL-1 receptor complex［J］.Immunity，1997，7(6):837-847.

［14］Choe JY，Grain B，Wu SR，et al.Interleukin 1 receptor dependence of serum transferred arthritis can be circumvented by tolllike receptor 4 signaling［J］.J Exp Med，2003，197 (4):537-542.

［15］李曉娟，劉 良，王文君，等.青藤堿抗炎抗風(fēng)濕作用機理研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2004，21(1):34-36.

［16］Wong PK，Campbell IK，Egan PJ，et al.The role of the interleukin-6 family of cytokines in inflammatory arthritis and bone turnover［J］.Arthritis Rheum，2003，48(5):1177-1189.

［17］劉 良，李曉娟，王培訓(xùn)，等.青藤堿對人外周單個核細胞IL-1β 和IL-8 細胞因子基因表達的影響［J］.中國免疫學(xué)雜志，2002，18(4):241-244.

［18］楊德森，劉 芳，曾繁典，等.青藤堿對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清及關(guān)節(jié)液細胞因子的影響［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用學(xué)雜志，2006，23(4):274-277.