黃黎月 莊國洪 丘勁華 陳 福 陶惠然 (廈門醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，廈門 361008)

糖尿病是心力衰竭發(fā)生的一個獨(dú)立危險因素，目前關(guān)于糖尿病心肌病變過程中心肌細(xì)胞凋亡作用的研究報(bào)道較少。心肌細(xì)胞凋亡與DM 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1，2］。Fas/FasL 信號系統(tǒng)是心肌細(xì)胞凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。誘騙受體3(Decoy receptor 3，DcR3)是腫瘤壞死因子受體(Tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族新成員，能競爭性地與FsaL 及LIGHT 結(jié)合并抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［3-5］，故提示DcR3 可能對DM 心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。DcR3 mRNA 在正常大鼠和DM 大鼠心肌組織的表達(dá)如何?外源性DcR3 重組蛋白對DM 心肌細(xì)胞凋亡有無保護(hù)作用?對DM 大鼠心肌凋亡相關(guān)分子的表達(dá)有何影響?這些問題目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，本文就此作初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Sprague-Dawiey(SD)大鼠60 只，體重(200±2)g，2 月齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供。自由飲食、水，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)Sigma 公司產(chǎn)品，大鼠腫瘤壞死因子-α(TNFα)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和γ-干擾素(IFN-γ)的ELISA 檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，Trizol 試劑、AMV 一步法RT-PCR 試劑盒購自上海生工公司。兔抗Caspase-8 mAb、Bcl-2mAb 和HRP 標(biāo)記的大鼠抗兔IgG 抗體購自Sigma 公司。DcR3 蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備(純度≥99%)［6］。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及DM 模型的建立 將大鼠隨機(jī)分成6 組，每組10 只。A 組:Normal(正常對照組);B 組:Normal +DcR3［0.8 mg/(鼠·d)］;C 組:DM組;D 組:DcR3 重組蛋白低劑量［0.4 mg/(鼠·d)］治療組;E 組:DcR3 重組蛋白中劑量［0.8 mg/(鼠·d)］治療組;F 組:DcR3 重組蛋白高劑量［1.2 mg/(鼠·d)］治療組。大鼠禁食(約8 h)不禁水，C、D、E、F 組大鼠于左下腹腔內(nèi)一次性注射STZ(50 mg/kg)，A、B 組大鼠注射與STZ 同體積的磷酸鹽緩沖液。48 h 后用血糖儀檢測血糖，重復(fù)2 次以非空腹血糖超過16.7 mmol/L 的大鼠為制模成功，本實(shí)驗(yàn)的制模成功率為100%，實(shí)驗(yàn)過程中有6 只大鼠死亡被剔除。

B、D、E、F 組大鼠每天一次尾靜脈注射相應(yīng)劑量的DcR3，A、C 組大鼠注射同體積的生理鹽水，連續(xù)用藥40 d，測大鼠血糖、尿糖、體重及尿量。40 d后處死大鼠，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.2.2 血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ 含量的檢測 摘除大鼠眼球取血，分離血清，-20℃凍存?zhèn)溆?。采用雙抗夾心ELISA 檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量。

1.2.3 RT-PCR 分析心、肝、脾、肺、腎、胰腺和睪丸組織中Fas、FasL 和DcR3 mRNA 的表達(dá) 用TRIzol試劑提取各組織器官中的總RNA，進(jìn)行RT-PCR。以2～4 μl 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，分別以擴(kuò)增DcR3、Fas、FasL 基因的引物，以β-actin 基因?yàn)閮?nèi)參照，進(jìn)行PCR。DcR3 基因mRNA 序列:上游引物:5'-TAG GCC ATG GAT GTG GCA G-3'，下游引物:5'-CAA GAT GCA TGC TCC AAG-3'，序列長度為320 bp。Fas 上游引物:5-'CAT GAC AAT CCA GGA AGC-3'，下游引物:5'-CCA AGG TCC TTC TGG ACC-3'，序列長度為220 bp 。FasL 上游引物:5'-GTA CCA TGG CGA TGC AGC AGC-3'，下游引物:5'-ATA CAA AGT ACA GCC CAG-3'，序列長度為580 bp。β-actin 上游引物:5'-TCT TCC AGC CCT CCT TCC TG-3'，下游引物:5'-CGT TTC TGC GCC GTT AGG T-3'，序列長度為409 bp。反應(yīng)條件為:95℃變性4 min，95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)數(shù)30，72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)(Quantity One-4.6)灰度分析各基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot 檢測上述組織Caspase-8、Bcl-2的蛋白表達(dá) ①SDS-PAGE:將組織研磨后，加細(xì)胞裂解液提取蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)。②轉(zhuǎn)膜:把分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。③Ag-Ab 反應(yīng):加入一抗，反應(yīng)1 h，洗滌液洗滌3 次;加入HRP 標(biāo)記的二抗，反應(yīng)1 h，洗滌。④顯色:DAB 顯色。結(jié)果判斷和數(shù)據(jù)處理:膠片或考馬斯蘭干膠后采用Gel-doc 200 掃描，用Quantity one 軟件進(jìn)行條帶分析。

1.2.5 心肌細(xì)胞凋亡的觀察 取各組大鼠左心室前壁組織，行常規(guī)脫水、包埋及組織切片，做HE 染色。光鏡下觀察并做半定量分析:隨機(jī)抽取C 組和E 組各10 張切片，400 倍高倍視野下，用標(biāo)準(zhǔn)的10×10 目鏡方格測試系統(tǒng)計(jì)數(shù)10 個視野凋亡細(xì)胞數(shù)目，取其均值。

2 結(jié)果

2.1 DcR3 對大鼠血糖、尿糖、體重及尿量的影響 DcR3 對正常大鼠血糖、尿糖、體重及尿量無明顯影響。A 組(Normal)大鼠血糖(6.9±0.12)mmol/L，尿糖(-)，體重(338.6±23.18)g，24 h 尿量(12.75±4.11)ml。B 組(Normal+DcR3)血糖(7.1±0.24)mmol/L，尿糖(-)，體重(353.6±28.31)g，24 h 尿量(13.23±5.17)ml，A 組與B 組間各項(xiàng)指標(biāo)無顯著性差異。C 組的大鼠血糖(22.6±3.77)mmol/L，尿糖(+++～++++)，體重(190.48±27.04)g，24 h 尿量(58.75±18.17)ml，各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于A 組(P ＜0.01)。不同劑量的DcR3 連續(xù)治療40 d 后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D、E、F 與C 組比較血糖呈下降趨勢，但無顯著性差異(P ＞0.05)。尿糖、體重及尿量差異無顯著性(P ＞0.05，數(shù)據(jù)略)。

2.2 大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 水平的變化 B 組與A 組比較，血清中TNF-α、IL-1β 和IFN-γ水平無顯著性差異(P ＞0.05);造模后40 d，C 組的TNF-α、IL-1β 較A 組的TNF-α、IL-1β 明顯增加(P ＜0.05，P ＜0.01);D、E、F 組與C 組相比，血清的TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 水平均有不同程度的降低(P ＜0.05，P ＜0.01，表1)。

2.3 各組織中Fas、FasL 和DcR3 mRNA 的表達(dá)

2.3.1 DcR3 mRNA 的表達(dá) 應(yīng)用RT-PCR 檢測A組、B 組、C 組、D 組、E 組及F 組大鼠各器官DcR3 mRNA 的表達(dá)。結(jié)果提示:A 組DcR3 mRNA 在心、脾、肺、腎中有明顯表達(dá)，睪丸組織中弱表達(dá)，其他組織中無表達(dá)。B 組DcR3 mRNA 在心、肺、腎、胰腺中有明顯表達(dá)，其他組織中無表達(dá)。C 組DcR3 mRNA 在肝、肺、腎中有明顯表達(dá)，其他組織中無表達(dá)。D 組DcR3 mRNA 在心、肝、肺、胰腺中有表達(dá)，其他組織中無表達(dá);E 組DcR3 mRNA 在心、肺、睪丸中有明顯表達(dá)，其他組織中無表達(dá);F 組DcR3 mRNA在心、肝、肺、腎中有明顯表達(dá)，其他組織中無表達(dá)(圖1)。DcR3 mRNA 的表達(dá)產(chǎn)物大小為320 bp，電泳結(jié)果與理論計(jì)算值相符。

2.3.2 Fas、FasL mRNA 的表達(dá) 應(yīng)用RT-PCR 檢測各組大鼠各器官中Fas mRNA 的表達(dá)。結(jié)果提示:Fas mRNA 在A 組大鼠心、肝、脾、肺、腎、胰腺、睪丸中均有表達(dá);B 組Fas mRNA 在心、肝、肺、腎、胰腺中均有表達(dá)，其他組織中無表達(dá);C 組Fas mRNA 在心、肝、脾、肺中有明顯表達(dá)，其他組織中無表達(dá);D 組Fas mRNA 在心、腎、胰腺中有表達(dá)，其他組織中無表達(dá)，E 組Fas mRNA 在心肌組織無表達(dá)，只在脾、睪丸組織中有表達(dá);F 組在心肌組織無表達(dá)，在脾、肺、腎中明顯表達(dá)(圖2)。Fas mRNA、FasL mRNA 的表達(dá)產(chǎn)物大小為220 bp 和585 bp，電泳結(jié)果與理論計(jì)算值相符。

FasL mRNA 在A 組大鼠心及脾、肺、腎、睪丸中有表達(dá)，其他組織中未見表達(dá);B 組FasL mRNA 在心及脾、肺、胰腺中有明顯表達(dá)，其他組織中無表達(dá);C 組FasL mRNA 在所有組織中均有表達(dá);D 組FasL mRNA 在心及脾、肺、腎、胰腺中有表達(dá)，其他組織無表達(dá);E 組FasL mRNA 在心、腎組織中無表達(dá)，其他組織中有明顯表達(dá);F 組FasL mRNA 在心及肝、肺、脾、胰腺中無表達(dá)，在腎、睪丸組織中有表達(dá)。

表1 DcR3 對大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 水平的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of DcR3 on TNF-α，IL-1β and IFN-γ in DM rats serum(±s，n=6)

表1 DcR3 對大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 水平的影響(±s，n=6)Tab.1 Effects of DcR3 on TNF-α，IL-1β and IFN-γ in DM rats serum(±s，n=6)

Note:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01 vs normal;3)P ＜0.05，4)P ＜0.01 vs DM.

圖1 RT-PCR 檢測各組織中DcR3 mRNA 的表達(dá)Fig.1 mRNA expression of DcR3 was measured by RTPCR DcR3

圖2 RT-PCR 檢測各組織中Fas、FasL mRNA 的表達(dá)Fig.2 mRNA expression of Fas and FasL was measured by RT-PCR

2.4 Caspase-8、Bcl-2 蛋白的表達(dá) 應(yīng)用Western blot 檢測各組大鼠各器官中Caspase-8、Bcl-2 蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示:Caspase-8 蛋白在A 組大鼠心及肝、腎中有表達(dá)，在其他組織中未見表達(dá);B 組Caspase-8 蛋白在心、脾、胰腺中有明顯表達(dá)，其他組織中無表達(dá);C 組Caspase-8 蛋白在心及肝、肺、腎、睪丸中有表達(dá)，而在脾、胰腺中無表達(dá);D 組Caspase-8 蛋白在心和睪丸中有表達(dá)，其他組織中無表達(dá);E 組Caspase-8 蛋白在肝、肺、睪丸中有表達(dá)，在心肌組織中無表達(dá);F 組Caspase-8 蛋白在肝、肺、胰腺、睪丸中有明顯表達(dá)，心及脾、腎中無表達(dá)。(圖3)。Caspase-8、Bcl-2 蛋白的表達(dá)產(chǎn)物分別為55 kD 和26 kD，電泳結(jié)果與理論計(jì)算值相符。

Bcl-2 蛋白在A 組大鼠心及脾、肺中有表達(dá)，在其他組織中未見表達(dá);B 組Bcl-2 蛋白在心、肝、肺、腎中有明顯表達(dá)，胰腺、脾及睪丸中無表達(dá);C 組Bcl-2 蛋白在肝、腎、睪丸中有弱表達(dá)，在心、脾、肺、胰腺組織中無表達(dá);D 組Bcl-2 蛋白在心、脾中有表達(dá)，而在其他組織中無表達(dá);E 組Bcl-2 蛋白在心、脾和肺中有表達(dá)，在肝、腎、胰腺和睪丸中均無表達(dá);F組Bcl-2 蛋白在心、脾、胰腺和睪丸中有明顯表達(dá)，其他組織中無表達(dá)。

2.5 心肌細(xì)胞凋亡的計(jì)算 與正常組相比DM 組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增加明顯，差異顯著(P ＜0.01)，見圖4;而DM+DcR3(0.8)組，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，與DM 組相比差異顯著(P ＜0.05)，見表2。

圖3 Western blot 檢測各組織中Caspase-8、Bcl-2 蛋白的表達(dá)Fig.3 Protein expression of Caspase-8 was measured by Western blot

圖4 心肌細(xì)胞的凋亡(HE，10 ×40)Fig.4 Apoptosis of myocardial cells(HE，10 ×40)

表2 重組蛋白DcR3 對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=6，apoptosis cells/mm2)Tab.2 Effects of DcR3 on myocardium apoptosis in rats(±s，n=6，apoptosis cells/mm2)

表2 重組蛋白DcR3 對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=6，apoptosis cells/mm2)Tab.2 Effects of DcR3 on myocardium apoptosis in rats(±s，n=6，apoptosis cells/mm2)

Note:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01 vs normal;3)P ＜0.05，4)P ＜0.01 vs DM.

3 討論

誘騙受體3(Decoy receptor 3，DcR3)是1998 年P(guān)itti 等［7］發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤壞死因子受體(Tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族成員，它能競爭性地與LIGHT 和FasL 結(jié)合并抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。對腫瘤細(xì)胞HT29 的生存能力分析表明，F(xiàn)asL 誘導(dǎo)HT29 細(xì)胞的凋亡具有劑量依賴性，最大效應(yīng)濃度為1～10 ng/ml，而在DcR3.Fc 存在的情況下，即使FasL 的濃度達(dá)到100 ng/ml，F(xiàn)asL 也不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。胰島移植的研究發(fā)現(xiàn)，DcR3 可抑制FasL、IFN-γ 誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防胰島移植后胰島原發(fā)性無功能的發(fā)生。給嚴(yán)重的非肥胖糖尿病且免疫缺陷大鼠用DcR3.Fc 培養(yǎng)的樹狀突細(xì)胞治療后，能延緩糖尿病的發(fā)病進(jìn)程和嚴(yán)重程度，提示DcR3 與DM 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程。研究表明心肌細(xì)胞凋亡參與缺血性心臟病、缺血再灌注損傷、心力衰竭、病毒性心肌炎等病理過程，并在其中發(fā)揮著重要作用。Fiordaiso 等［8］用STZ 誘導(dǎo)大鼠DM 3 d 后心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，在4 周時心肌細(xì)胞30%呈散在點(diǎn)狀凋亡，存活的心肌細(xì)胞體積增大。Backlund等［9］研究發(fā)現(xiàn)隨著DM 心功能障礙的加重，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。已有研究證實(shí)在心肌細(xì)胞凋亡的同時促凋亡相關(guān)分子Fas、FasL 和Bax 的表達(dá)明顯上調(diào)，凋亡抑制分子Bcl-2 隨著細(xì)胞凋亡的增加表達(dá)明顯減弱，而且Fas 表達(dá)水平與DM 的病程進(jìn)展相一致［10］。本研究發(fā)現(xiàn)在STZ 誘導(dǎo)大鼠DM 40 d時，心肌細(xì)胞的胞漿濃染、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞凋亡明顯增加，存活的心肌細(xì)胞肥大。心肌組織中Fas 和FasL 的表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2 的表達(dá)下調(diào)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，DM 大鼠心肌細(xì)胞凋亡時心肌組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和腫瘤壞死因子-α 轉(zhuǎn)化酶(TACE)高表達(dá)［11］。TNF-α 刺激白介素1(IL-1)等細(xì)胞因子的生成并參與心肌病理變化過程。本研究各實(shí)驗(yàn)組大鼠連續(xù)用DcR3 重組蛋白40 d 后，空白對照組大鼠血清中IL-1β、TNF-α 和IFN-γ 水平與正常對照組比較無顯著性差異;損傷組的TNF-α、IL-1β 和IFN-γ 水平較正常對照明顯升高;三個劑量的DcR3 治療組均可使DM 大鼠血清的IL-1β、TNF-α 和IFN-γ 水平有不同程度的顯著性降低，且TNF-α 和IFN-γ 水平的降低呈明顯的劑量依賴性。

通過RT-PCR 檢測各組大鼠心肌組織中DcR3 mRNA 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外源性DcR3 重組蛋白對DM 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用可能與細(xì)胞表面DcR3(內(nèi)源性)的表達(dá)差異有相關(guān)性，中劑量和高劑量的DcR3 作用于DM 大鼠后，增加了心肌組織中DcR3 mRNA 的表達(dá)。降低了心肌組織Fas mRNA 和FasL mRNA 的表達(dá)，使FasL 與心肌組織中的效應(yīng)細(xì)胞表面Fas 的結(jié)合減少，降低了效應(yīng)細(xì)胞的活化，從而減少了相關(guān)細(xì)胞因子的分泌;高表達(dá)的DcR3 能競爭性地與FsaL 結(jié)合，抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，我們推測DcR3 的差異性表達(dá)可能是選擇性抑制心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本文應(yīng)用Western blot 檢測各組大鼠各器官中Bcl-2、Caspase-8 蛋白的表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 僅在DM組大鼠肝、腎和睪丸組織中有表達(dá)，心肌組織中均未見表達(dá);Caspase-8 在DM 組大鼠除脾和胰腺之外，心肌和其他各組織均有明顯表達(dá)，提示Bcl-2、Caspase-8 與DM 心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生相關(guān)。給予外源性DcR3 重組作用于DM 大鼠后，心肌組織中Bcl-2 的表達(dá)上調(diào)，Caspase-8 蛋白的表達(dá)下調(diào)。Bcl-2 促進(jìn)細(xì)胞生存，延長細(xì)胞壽命，抑制細(xì)胞凋亡的作用是增高線粒體的跨膜電位和阻止線粒體膜通透性的改變，使Bcl-2 的表達(dá)上調(diào)，阻止凋亡啟動因子如細(xì)胞色素C 等的釋放，切斷細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8 是細(xì)胞凋亡過程中介導(dǎo)死亡受體途徑的啟動酶，中劑量和高劑量的DcR3 使DM 大鼠心肌Caspase-8 蛋白表達(dá)下調(diào)，提示可能通過抑制死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑，抑制了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性DcR3 可使DM 大鼠心肌組織中DcR3 mRNA 的表達(dá)增加，F(xiàn)as mRNA和FasL mRNA 的表達(dá)下調(diào)，Bcl-2 的表達(dá)上調(diào)，Caspase-8 蛋白的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞因子水平降低，使DM 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的百分率下降。這對認(rèn)識DcR3 抑制DM 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用，以及深入研究糖尿病心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供新的啟示。

［1］Cao L，Wang Y，Zhou G，et al.Attenuation by metallothionein of early cardiac cell death via suppression of mitochondrial oxidative stress results in a prevention of diabetic cardiomyopathy［J］.J Am Coll Cardiol，2006，48(8):1688-1697.

［2］Sajjad A，Novoyatleva T，Vergarajauregui S，et al.Lysine methyltransferase Smyd2 suppresses p53-dependent cardiomyocyte apoptosis［J］.Biochim Biophys Acta，2014，8:2556-2562.

［3］Wortinger MA，F(xiàn)oley JW，Larocque P，et al.Fas ligand-induced murinepulmonary inflammation is reduced by a stable decoy receptor 3 analogue［J］.Immunology，2003，110:225-233.

［4］Wang W，Zhang M，Sun W，et al.Reduction of decoy receptor 3 enhances TRAIL-mediated apoptosis in pancreatic cancer［J］.PLoS One，2013，8(10):e74272.

［5］Shen E，Li Y，Li Y，et al.Rac1 is required for cardiomyocyte apoptosis during hyperglycemia［J］.Diabetes，2009，58 (10):2386-2395.

［6］李文珠，陶惠然，顏江華，等.DcR3 的構(gòu)建、表達(dá)純化及特異性鑒定［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2006，22(2):151-153.

［7］Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DA，et al.Genomic of decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer［J］.Nature，1998，369:699-703.

［8］Fiordaliso F，Li B，Latimi R，et al.Myocyte death in streptozotocininduced diabetes in rats in angiotensin dependent［J］.Lab Invest，2000，80(4):513.

［9］Backlund T，Palojoki E，Saraste A，et al.Sustained cardiomcyte apoptosis and left ventricular remodeling after myocardial infarction in experimental diabetes［J］.Daibetologia，2004，47(2)325-330.

［10］Ho FM，Liu SH，Liu CS，et al.High Glucose induced apoptosis in human endothelial cells is mediated by sequential activation of CjunNH(2)-teminalkinase and caspase-3［J］.Circulation，2000，101(22):2618-2624.

［11］鐘文亮，莊維特，陳 剛，等.腫瘤壞死因子-α 和腫瘤壞死因子-α 轉(zhuǎn)化酶在糖尿病心肌病變大鼠心肌中的表達(dá)［J］.中華糖尿病雜志，2005，13(4):306-308.