徐 立 王峻松 閆 巖 劉 磊 戴鶴玲 付 嘉 方艷秋 譚 巖

(吉林大學第二醫(yī)院檢驗科，長春 130041)

抗磷脂抗體綜合征(Antiphospholipid syndr- ome，APS)為一組自身免疫系統(tǒng)疾病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為血栓形成、習慣性流產(chǎn)和血小板減少癥等。APS 除原發(fā)性外，也有繼發(fā)性疾病。血栓形成是APS 突出的臨床表現(xiàn)和主要的病理變化［1］。Charavi 等［2］的研究認為，APS 患者血栓形成的基礎為血清中存在高濃度抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody，aPL)。aPL 是針對帶負電荷磷脂的一組自身抗體，主要包括磷脂結合蛋白如β2-糖蛋白1(β2-glycoprotein l，β2-GP1)、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、annexinV 等而產(chǎn)生病理生理反應［3］。研究認為β2-GP1 是aPL 的主要靶抗原之一［4，5］，其是肝細胞合成的并存在于血漿中的一種糖蛋白，由于其本身存在磷脂結合位點，又稱為載脂蛋白H(ApoH)，是抗磷脂抗體和磷脂結合的輔助因子。自身免疫系統(tǒng)疾病免疫細胞參與其發(fā)病機制是必不可少的，初始CD4+T 細胞可分化為Th1、Th2 和Th17、Treg 4 個 主 要 的 細 胞 亞 群，Th17、Treg 亞群不同于經(jīng)典的Th1、Th2 亞群，其與自身免疫性疾病和感染免疫有密切關系，通過產(chǎn)生特征性的細胞因子發(fā)揮其功能［6］。TGF-β 單獨可誘導初始CD4+T 細胞分化為Treg 細胞，分泌TGF-β 并表達標志性分子Foxp3，主要維護機體免疫平衡;低濃度的TGF-β 和IL-6 的聯(lián)合可誘導初始CD4+T 細胞分化為Th17 細胞，主要分泌lL-17細胞因子發(fā)揮其功能。因此，TGF-β 這種雙重效應在T 細胞分化過程中具有重要的作用［7］。Treg細胞和Th17 細胞已成為當今免疫學方面研究的熱點之一，Th17/Treg 平衡越來越多地得到專家們的認可和關注，資料顯示CD4+CD25+Treg/Th17細胞失衡在許多免疫性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。然而CD4+CD25+Treg/Th17 細胞失衡是否參與調(diào)控抗磷脂綜合征的發(fā)病機制國內(nèi)外鮮見報道。

為了探索CD4+CD25+Treg/Th17 數(shù)量與比值的變化是否調(diào)控APS 的發(fā)病，本研究組以原核表達人β2糖蛋白1(rhβ2GP1)免疫BALB/c 小鼠建立APS 動物模型，應用流式細胞技術檢測小鼠PBMC中CD4+CD25+Treg/Th17 細胞頻率及比值變化，揭示APS 發(fā)病的細胞免疫病理基礎，為疾病治療尋找靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PE-anti-CD4 單抗、FITC-anti-CD25單抗及同型對照γ1/γ2(BD 公司)，PE-anti-IL-17 單抗(eBioscience)，小鼠抗人β2GP1 抗體(鼎國生物公司)，辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG(北京中山生物技術公司)，CFA(Sigma)，心磷脂標準品(Sigma)，β2GP1 標準品(Advtech)，IL-6、IL-2、IL-17、TGF-β 定量ELISA 試劑盒(R＆D 公司)。

1.2 實驗動物 BALB/c 小鼠，雌性，8～10 周，購于吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心，無特定病原菌(Specific pathogen free，SPF)條件下飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 人β2糖蛋白1 的重組表達詳見文獻［8］。

1.3.2 實驗性APS 模型的建立詳見文獻［9］。

1.3.3 外周血CD4+CD25+Treg、Th17 細胞的檢測分別在免疫后4、8、12、16、20 周無菌取小鼠尾靜脈血，肝素抗凝。取100 μl 全血，分別加入抗CD4、抗CD25、抗IL-17 抗體各10 μl，另設對照管，加入同型陰性對照γ1/γ2，室溫孵育20～30 min，加入紅細胞裂解液，振蕩混勻，室溫孵育10 min，1000 r/min 洗滌5 min，棄上清，將細胞懸浮于0.5 ml PBS 洗滌液中，振蕩混勻后上機檢測淋巴細胞亞群及CD4+CD25+Treg、Th17 細胞亞群水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行ANOVA 分析，組間比較采用方差分析，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 β2GP1 誘導的EAPS 小鼠APS 標志變化 與對照組相比，模型組小鼠的anti-β2GP1 和aCA 滴度升高，流產(chǎn)率升高，PLT 降低，APTT 延長，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。結果見圖1。

圖1 模型組APS 標志物的變化Fig.1 Values of markers in EAPS

圖2 流式細胞術檢測4 至20 周Treg 細胞和Th17 細胞變化Fig.2 Detection of Treg and Th17 cells from 4 w to 20 w by flow cytometry

圖3 各組CD4 +CD25 +Treg/Th17 細胞頻率變化比較Fig.3 Compared with control group，alteration of percentages and ratio of CD4 +CD25 +Treg/Th17

2.2 小鼠PBMC 中CD4+CD25+Treg、Th17 細胞的變化 分別在免疫后4、8、12、16 和20 周流式檢測模型及對照組小鼠的CD4+CD25+Treg 和Th17 細胞在CD4+T 細胞中的頻率，結果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，CD4+CD25+Treg 細胞頻率在4、8 周未見明顯變化(P ＞0.05)，但12 周后開始逐漸下降(P ＜0.05);而Th17細胞頻率隨時間增加逐漸升高，與同時間段對照相比差異顯著(P ＜0.05);CD4+CD25+Treg/Th17 比值隨時間逐漸下降，與正常對照組相比差異顯著(P ＜0.05)。對照組在不同時間點的兩種細胞的頻率均無差異(P ＞0.05)。結果見圖2、3。

圖4 與對照組比較，EAPS 組細胞因子水平的變化Fig.4 Compared with control group，values of cytokines in EAPS

2.3 β2GP1 誘導的EAPS 小鼠免疫因子水平變化 與對照組相比，β2GP1 誘導的EAPS 小鼠靜脈血中IL-17、IL-2 及IL-6 水平明顯升高，而TGF-β 水平下降(P ＜0.05)。結果見圖4。

3 討論

抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome，APS)為一類系統(tǒng)性自身免疫疾病，其特征主要為血栓形成、習慣性流產(chǎn)及一組自身抗體持續(xù)陽性［10］。研究表明，血清中存在高滴度的抗磷脂抗體(Antiphospholipid antibody，aPL)是患者形成血栓的關鍵［11］，而其中β2糖蛋白1(beta-2-glycoprotein 1，β2GP1)又是aPL 的關鍵靶抗原，是磷脂與其抗體(anti-β2GP1)結合的輔助因子，在APS 血栓形成的病理過程中發(fā)揮著重要作用，其主要在肝臟合成［12］。

自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病的關鍵是正常的免疫平衡被打破，繼而產(chǎn)生了一系列針對自身正?？乖目贵w，從而引發(fā)了強烈免疫應答［13］。CD4+CD25+Treg 是由Sakaguchi 等［14］在1995 年首先提出來的，其缺失可引起小鼠自身免疫性疾病，而過繼免疫則可預防其發(fā)生，其主要表達CD4、CD25 和標志性分子Foxp3，后者對此類細胞在胸腺內(nèi)發(fā)育和功能維持具有重要作用。CD4+CD25+Treg 具有免疫抑制和免疫無能兩大特性，對維持機體自身免疫耐受具有重要作用，其數(shù)量或功能改變均可導致免疫失衡，尤其減少可導致自身免疫性疾病的發(fā)生［15-18］。Th17 主要分泌IL-17A 而被命名。其還可以分泌IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)等細胞因子。在自身免疫性疾病及炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸過程中具有重要的作用，視黃酸相關孤兒核受體(RORyt)為Th17 主要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控Th17 分化。Treg 和Th17 細胞的平衡對免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用，自身免疫性疾病與感染性疾病往往表現(xiàn)為兩者的失衡。Treg 和Th17 細胞的分化調(diào)節(jié)主要通過不同的細胞因子及相關轉(zhuǎn)錄因子介導的。IL-17 為促炎因子引起炎癥和自身免疫反應。CD4+CD25+Treg 調(diào)節(jié)T細胞則具有有較強的免疫抑制作用。促炎性Th17細胞與抑制性Treg 細胞失衡可能是自身免疫性疾病發(fā)病的一個關鍵因素，因此，調(diào)節(jié)Th17/Treg 細胞比例，糾正兩者的失衡可能成為自身免疫性疾病治療的一個新靶點。

在本研究中，首先應用重組hβ2GP1 免疫小鼠，成功誘導出了自身抗體anti-β2GP1 和aCA，并出現(xiàn)了APS 相關的促凝血表現(xiàn):APTT 延長及血小板升高等。EAPS 模型組細胞IL-17、IL-6 及IL-2 滴度顯著升高，而TGF-β 滴度顯著降低。免疫4～8 周，模型組CD4+CD25+Treg 細胞比率基本無改變，而后逐漸降低，均低于對照組。因前4 周為自身反應性T/B 淋巴細胞增殖活化時期，CD4+CD25+Treg 與效應性CD4+T 細胞暫時維持動態(tài)平衡，此時機體對自身組織仍處于耐受狀態(tài)［19］。同時，源于自身免疫應答產(chǎn)生的大量致炎因子如IL-17［20］、IL-6［21］、TGF-β等均可不同程度抑制CD4+CD25+Treg 的功能，因此該代償性平衡是有限度的，一旦平衡被打破，CD4+CD25+Treg 細胞比率則開始下降，但Th17 細胞在IL-6 和低濃度TGF-β 同時作用的情況下表達逐漸升高，均高于對照組。當CD4+CD25+Treg 的抑制功能不足以維持免疫平衡，以致其他效應性CD4+T 細胞不斷增殖，CD4+CD25+Treg/Th17 比值明顯低于對照組，就會導致APS 的發(fā)生。該研究結果揭示，CD4+CD25+Treg/Th17 在EAPS 免疫病理發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究結果顯示EAPS 小鼠血漿中Th17/Treg 失衡(細胞數(shù)量減少或比例改變)，揭示了Th17/Treg 失衡在APS 免疫病理發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。CD4+CD25+Treg/Th17 細胞平衡將作為APS 病理機制及可能的治療新靶點而備受關注。本研究將在后續(xù)實驗中通過口服低劑量抗原建立免疫耐受模型，通過干預及阻斷進一步證實rhβ2GP1耐受反應的主動抑制可能是由TGF-β 介導的［22，23］，同時來驗證CD4+CD25+Treg/Th17 在EAPS 的發(fā)病機制中的重要作用。

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