章佳妮

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214000)

亞硝酸鹽是一種普遍存在于生物體中的化合物，是氮循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物。目前認(rèn)為，一定量的亞硝酸鹽在胃中會(huì)與仲胺、叔胺和酰胺等反應(yīng)生成亞硝胺類(N-亞硝胺)，而這類物質(zhì)對(duì)胃和食道具有強(qiáng)致癌性［1］。高濃度的亞硝酸鹽能使人體血液中的低鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化成沒有攜帶氧能力的高鐵血紅蛋白，從而引起高鐵血紅蛋白癥(缺氧)［2］。因此，亞硝酸鹽對(duì)人體健康具有極大的危害，尤其是對(duì)嬰兒和懷孕的婦女［3］。然而，由于其良好的殺菌抑菌作用［4］，亞硝酸鹽至今仍被用做重要的食品添加劑，以抑制厭氧微生物的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)還具有護(hù)色作用［5］。在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2760食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)亞硝酸鹽的含量做出了明確的限量規(guī)定，該規(guī)定指出，在腌制品中亞硝酸鹽的含量不能超過(guò)30 mg/kg。

亞硝酸鹽的含量在食品檢驗(yàn)中是一項(xiàng)重要的理化檢驗(yàn)項(xiàng)目，也是食品分析實(shí)驗(yàn)課程食品添加劑測(cè)定一章中的重要內(nèi)容。但是在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)教學(xué)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)工作中，由于實(shí)際樣品亞硝酸鹽含量不同，GB 5009．33－2010中鹽酸萘乙二胺法測(cè)定亞硝酸鹽的含量在取樣量、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制上存在一定的不確定性。為了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可操作性，筆者以鴨胗腌制品作為樣品，針對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行摸索，使試驗(yàn)條件適合于學(xué)生及相關(guān)工作人員操作。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 原料。市售鴨胗腌制品。

1．1．2 主要試劑。乙酸鋅溶液(220 g/L)，亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)，飽和硼砂(50 g/L)，鹽酸萘乙二胺溶液(2 g/L)，對(duì)氨基苯磺酸溶液(4 g/L)，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(250 μg/ml)，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液(10μg/ml)等，均為分析純。

1．1．3 主要儀器設(shè)備。水浴鍋，組織搗碎機(jī)，分光光度計(jì)，分析天平，恒溫干燥箱等。

1．2 方法

1．2．1 最大吸收波長(zhǎng)的確定。分別移取2 ml和4 ml的10μg/ml亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液置于50 ml容量瓶中，并在每個(gè)容量瓶中各加入2 ml對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻。保持靜置，3～5 min后，加入1 ml鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻。保持靜置，15 min后，在波長(zhǎng)460～580 nm范圍內(nèi)，以10～20 nm的間隔測(cè)吸光度，并且注意在峰值附近，以5 nm為間隔測(cè)一次吸光度，全部測(cè)完后，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出吸光度波長(zhǎng)曲線。

1．2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定與測(cè)定。取7個(gè)50 ml容量瓶，分別加入0．00、0．50、1．00、1．50、2．00、2．50、3．00 ml亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(相當(dāng)于 0、5、10、15、20、25、30 μg 亞硝酸鈉)，在這7個(gè)容量瓶中分別加入2 ml對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻。保持靜置，3～5 min后加入鹽酸萘乙二胺溶液1 ml，加水至刻度，混勻，保持靜置。15 min后在分光光度計(jì)上于538 nm波長(zhǎng)處用1 cm比色杯，以未加入亞硝酸鈉的溶液即零管作為參比池調(diào)吸光度零點(diǎn)，分別測(cè)定其余6個(gè)容量瓶中溶液的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．3 樣品的前處理及測(cè)定。

1．2．3．1 取樣量的確定。分別稱取5、10、15 g的市售鴨胗腌制品進(jìn)行預(yù)處理，并進(jìn)行亞硝酸鹽含量的測(cè)定。

1．2．3．2 樣品預(yù)處理。稱取不同用量經(jīng)絞碎混勻的鴨胗試樣，置于100 ml小燒杯中，加15 ml硼砂飽和溶液，攪拌均勻。另準(zhǔn)備70℃左右的水300 ml，在漏斗上將試樣洗入500 ml容量瓶中，于沸水浴中加熱15 min，取出后冷卻至室溫。然后一面轉(zhuǎn)動(dòng)，一面加入亞鐵氰化鉀溶液5 ml，搖勻，再加入乙酸鋅溶液5 ml，以沉淀蛋白質(zhì)，加水定容至刻度，搖勻，在冰箱4℃放置0．5 h，除去上層脂肪，清液用濾紙干過(guò)濾，棄去初濾液30 ml，濾液備用。

1．2．3．3 樣品中亞硝酸鹽含量的測(cè)定。分別用移液管吸取25．0 ml 2份經(jīng)過(guò)預(yù)處理的濾液于50 ml容量瓶中，試樣管和空白中分別加入2 ml對(duì)氨基苯磺酸溶液(4 g/L)，混勻，保持靜置。3～5 min后各加入1 ml鹽酸萘乙二胺溶液加水定容至刻度，混勻，保持靜置。15 min后，在分光光度計(jì)上用1 cm比色杯以未加入亞硝酸鈉的溶液即零管作為參比池，分別測(cè)定各溶液的吸光度值，計(jì)算得到試樣中亞硝酸鹽質(zhì)量的平均值。

其中試樣中亞硝酸鹽的含量按下式進(jìn)行計(jì)算:

式中，X為試樣中亞硝酸鹽的含量(mg/kg);m為試樣質(zhì)量(g);A為測(cè)定用樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量(g);V1為試樣處理液總體積(ml);V2為測(cè)定用樣液體積(ml)［6］。

1．2．4 加標(biāo)回收試驗(yàn)。根據(jù)加標(biāo)試驗(yàn)的5項(xiàng)原則［7］，在測(cè)定的樣品中分別加入0．10、0．15、0．20 ml 3 個(gè)不同體積的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(250μg/ml)。分別測(cè)定含量并計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2．1 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 配制2種濃度的亞硝酸鹽溶液a、b(該試驗(yàn)中使用的是亞硝酸鈉)，在460～580 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，分別測(cè)定吸光度值。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制其吸收光譜曲線(圖1)。從圖1中可以看出，2種濃度的最大吸收波長(zhǎng)均為538 nm，并且在此波長(zhǎng)下，2種濃度的亞硝酸鹽溶液的吸光度值從低濃度時(shí)的0．259增加到高濃度時(shí)的0．514。從而確定，在該試驗(yàn)操作系統(tǒng)下，亞硝酸鹽的測(cè)定可在波長(zhǎng)為538 nm處進(jìn)行。

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按上述所示濃度，利用亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確配制工作溶液，在波長(zhǎng)538 nm處，測(cè)定各工作液的吸光度值，以亞硝酸鹽的含量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。其線性回歸方程為y=0．012 7x+0．005 7，相關(guān)系數(shù)為 R=0．999 2，表明線性關(guān)系良好，可信度高。

2．3 樣品中亞硝酸鹽的測(cè)定 分別稱取5、10、15 g的鴨胗腌制品，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，不同取樣量的測(cè)定結(jié)果見表1。樣品在一定波長(zhǎng)下吸光度值的大小與樣品中該物質(zhì)的濃度成正比［8］，故應(yīng)讓吸光度值在一定范圍內(nèi)，否則就不能保證是良好的線性關(guān)系，從而影響待測(cè)數(shù)據(jù)的正確性。在該試驗(yàn)中，取樣量如果偏小，待測(cè)樣液中亞硝酸鹽的含量就會(huì)偏低，從而影響分光光度計(jì)測(cè)定值的線性關(guān)系。反之，取樣量過(guò)大，還會(huì)影響亞硝酸鹽的提取效果?？梢娙恿渴欠窈线m將影響試驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確。

從表1中可以看出，隨著取樣量的增加，測(cè)定所得的結(jié)果也逐漸增加，但是相對(duì)偏差逐漸減小?？梢姡恿康拇笮?duì)試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果影響較大，合理的取樣量是試驗(yàn)的重要關(guān)鍵部分之一。針對(duì)該試驗(yàn)，選取取樣量為15 g的樣品較為合適。

表1 樣品中亞硝酸鹽的含量

從表1還可以得出，鴨胗腌制品的亞硝酸鹽含量為15．36 mg/kg。參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760－2014，亞硝酸鈉在腌制品中的殘留量≤30 mg/kg，該試驗(yàn)所用的樣品，低于殘留量限值，符合標(biāo)準(zhǔn)。

2．4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果 在取樣量為15 g的樣品中(已知其亞硝酸鹽含量為 0．46 μg/ml，取 25 ml)分別加入 0．10、0．15、0．20 ml 3個(gè)不同體積的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述樣品測(cè)定方法進(jìn)行亞硝酸鹽含量的測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 樣品回收率

從表2可以看出，樣品的回收率均大于96%，該方法準(zhǔn)確可靠，符合分析方法的要求。

3 結(jié)論

通過(guò)以上試驗(yàn)，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009．33-2010，該試驗(yàn)主要對(duì)國(guó)標(biāo)中的方法在以下幾個(gè)部分進(jìn)行了改進(jìn):一，增加了取樣量。由于鴨胗制品中亞硝酸鹽含量比較低，取樣量過(guò)小，會(huì)因?yàn)閮x器誤差造成試驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，而取樣量過(guò)大，又會(huì)影響提取效果。二，在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制試驗(yàn)時(shí)，增加了亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液的用量，以保證分光光度計(jì)數(shù)據(jù)的可靠性。改進(jìn)后的方法重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度好，推薦在日常的實(shí)驗(yàn)教學(xué)和工作中使用。

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