穆曉琨，畢 琳

(1．肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶526061;2．四川省犍為縣動物疫病預(yù)防控制中心，四川樂山614400)

急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)原名急性腎衰竭，是一種涉及多學(xué)科的臨床常見危重病癥，該疾病突發(fā)性高，病程進展快，死亡率高，且發(fā)病率逐年上升［1］。AKI可由感染、燒傷、腎動脈狹窄等各種原因引起。研究表明，藥物是導(dǎo)致AKI的首位病因，濫用藥物是急性腎損傷的一大誘因，在所有的急性腎臟損傷患者中膿毒癥是臨床誘發(fā)AKI的最重要原因之一［2－3］。膿毒癥是病原微生物侵入機體所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，臨床上證實有細菌存在或有高度可疑感染灶，可引起多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，本質(zhì)上而言膿毒癥是機體對感染性因素的反應(yīng)。一旦膿毒癥合并AKI，死亡率將高達70%［4］。因此，膿毒癥致AKI是危重急救醫(yī)學(xué)和腎臟病學(xué)著重解決的難題。

Nod樣受體蛋白3(NLRP3)是一種存在于細胞胞漿中的多蛋白復(fù)合物，主要是由NLRP3、ASC和Caspase-1相互結(jié)合形成，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分［5－7］。核心蛋白NLRP3被激活后，通過銜接蛋白ASC以及無活性的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1(caspase-1)，形成 NLRP3炎癥復(fù)合體，進而活化caspase-1，切割I(lǐng)L-18和IL-1β的前體，使其成

熟并釋放。研究表明，NLRP3炎癥小體與多種代謝性疾病有密切關(guān)系，如阿爾茨海默病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化等［8－9］。但是，迄今為止NLRP3炎癥小體的具體運作模式尚不清楚。筆者通過盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal ligation and puncture，CLP)模型構(gòu)建大鼠膿毒癥AKI模型并使用相關(guān)分子生物學(xué)手段，初步研究證實了NLRP3炎癥小體在大鼠膿毒癥AKI過程中的作用，探討其防治膿毒癥所致AKI的可能機制。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，購自北京普利來公司;大鼠尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所;蘇木精和伊紅，購自中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司;兔抗鼠多克隆抗體NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18 和 β-actin均購自美國Abcam公司;大鼠血清IL-1β和IL-18 ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1．2 動物及分組 健康雄性SD大鼠48只，7～8周齡，體質(zhì)量250～300 g。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為假手術(shù)組(n=18)和CLP組(n=30)，2組再隨機平均分為6個時間點(0、3、6、12、18、24 h)。

1．3 模型制備 采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法制備膿毒癥模型。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛溶液(3．5 ml/kg)麻醉，腹壁正中切開2 cm，拉出盲腸后在盲腸總長度50%處結(jié)扎，用25號針頭在結(jié)扎線下5 mm處貫穿盲腸1次后放回盲腸并關(guān)腹。假手術(shù)組除不結(jié)扎和盲腸穿刺外，其余操作同CLP組。術(shù)后將大鼠分籠飼養(yǎng)，禁食不禁水。

1．4 樣本采集 各組在相應(yīng)時間點摘除存活大鼠眼球取血2 ml，以3 000 r/min離心10 min后留取血清備用。大鼠處死后，開腹，開放腎靜脈，用4℃的生理鹽水由腹主動脈注入腎臟沖洗，直至腎臟變白，取右腎組織，用錫箔紙包好后置入液氮罐中，冷凍保存，備用。

1．5 檢測指標(biāo) 采用ELISA法嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測血清BUN、Scr、IL-1β和IL-18水平;取相同腎組織，蘇木素伊紅(HE)染色后，使用光學(xué)顯微鏡觀察其病理學(xué)改變;將冷凍的腎組織制備成組織勻漿后，使用考馬斯亮藍法(Bradford)檢測蛋白質(zhì)含量，采用Western Blot法檢測腎組織勻漿NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β 和IL-18 的表達量，并檢測目標(biāo)蛋白及內(nèi)參β－actin條帶的光密度比值，半定量分析其表達情況。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS16．0統(tǒng)計軟件包對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。不同組間的差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2．1 腎功能變化 從圖1可以看出，與假手術(shù)組相比，CLP組在手術(shù)后3 h血清中BUN和Scr的表達出現(xiàn)增高，6 h差異顯著(P＜0．05)，隨著手術(shù)后時間的延長呈現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢，24 h達到最高值(P ＜0．01)。

2．2 腎組織的病理學(xué)變化 從圖2可以看出，術(shù)后24 h假手術(shù)組大鼠的腎小球結(jié)構(gòu)基本正常;CLP組大鼠術(shù)后12 h腎小管上皮細胞腫脹，腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤;CLP術(shù)后24 h皮髓質(zhì)交界處近端小管壞死顯著，彌漫性細胞崩解及壞死，損傷進一步加重。

2．3 腎組織NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表達變化 采用Western blot法檢測了假手術(shù)組術(shù)后24 h以及CLP組術(shù)后0、6、12、18和24 h大鼠腎組織中NLRP3的表達情況。從圖3可以看出，CLP組NLRP3的表達均高于假手術(shù)組。與假手術(shù)組相比，CLP術(shù)后6 h差異顯著(P＜0．05)，12、18和24 h呈極顯著性差異(P＜0．01)，其中18 h表達量最高。

2．4 腎組織ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表達變化 采用Western blot法檢測了假手術(shù)組術(shù)后24 h以及CLP組術(shù)后12 h和24 h大鼠腎組織中ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表達情況。從圖4可以看出，與假手術(shù)組相比，CLP術(shù)后12 h和24 h均差異極顯著(P＜0．01或P＜0．001)。

2．5 血清中IL-1β和IL-18水平的變化 ELISA檢測結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比CLP術(shù)后12 h和24 h大鼠血清IL-1β和IL-18水平均差異極顯著(IL-1β為P＜0．01;IL-18為P＜0．001)(圖5)。

3 討論

AKI是一種較常見的臨床綜合征，可發(fā)于醫(yī)院各大科室 。感染導(dǎo)致膿毒癥是引起AKI最重要的因素之一［2，10］。研究膿毒癥AKI過程中分子水平的變化，有利于尋找防治膿毒癥所致AKI的藥物靶點，從而降低其病死率。

該試驗采用CLP法制備大鼠膿毒癥模型，即目前公認的與臨床相關(guān)性較強的膿毒癥模型［11］。該試驗中膿毒癥大鼠術(shù)后6 h血清BUN和Scr水平顯著高于假手術(shù)組，并且隨著時間的延長呈遞增趨勢;病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠術(shù)后24 h腎小管上皮細胞變性，皮髓質(zhì)交界處近端小管壞死顯著，表明膿毒癥可導(dǎo)致AKI，并且隨著時間的延長而損傷加重。

機體在天然的免疫系統(tǒng)的幫助下，可以快速識別外來的多種非特異性損傷，而模式識別受體則是天然免疫細胞激活的必要條件［12－13］。近年來，作為胞質(zhì)內(nèi)模式識別體的NLRP3炎癥小體與損傷的密切關(guān)系日益受到廣泛關(guān)注。NLRP3被激活后形成的NLRP3炎癥小體，可剪切活化caspase-1蛋白前體，細胞可以產(chǎn)生和釋放有生物活性的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18都屬于IL-1超家族，主要由單核巨噬細胞分泌，作為機體內(nèi)重要的細胞因子，IL-1β和IL-18作用于免疫相關(guān)細胞，促使這些細胞產(chǎn)生相應(yīng)的免疫效應(yīng)［14］。

研究表明，機體的多種炎癥反應(yīng)(如動脈粥樣硬化、糖尿病等)都存在 NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18軸的紊亂［15－16］。該研究中CLP組大鼠腎組織NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18和血清IL-1β/IL-18水平均顯著升高，且隨著術(shù)后時間的延長而遞增，表明膿毒癥引起的AKI可能與激活NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18軸有關(guān)，而抑制 NLRP3的激活可能有助于減輕膿毒癥AKI的發(fā)生和發(fā)展。該研究結(jié)果為膿毒癥AKI的防治提供試驗基礎(chǔ)。

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