熊燕妮，江瑞晶，方 浩，韓 雪，王 丹 (江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430056)

豇豆俗稱角豆，為蝶形花科1年生纏繞草本植物，在我國各地普遍栽培，深受廣大消費者的喜愛。內(nèi)生菌是從表面消毒的植物組織中分離得到的，不使植物的表型特征和功能發(fā)生改變的微生物。植物內(nèi)生菌可在植物體內(nèi)定殖，從宿主植物中獲得養(yǎng)分和穩(wěn)定的生長環(huán)境，不易受外界條件的影響，可長期發(fā)揮生物學(xué)作用［1－2］。內(nèi)生菌在漫長地與植物共生進化的過程中已經(jīng)可以很好地利用植株所提供的條件和植株的生長環(huán)境［3］;同時，有不少內(nèi)生菌對植株本身產(chǎn)生有益的作用，內(nèi)生菌與植株之間是共存互惠的關(guān)系［4］。目前，利用植物內(nèi)生菌制備基因工程益生菌和基因工程生防菌已成為內(nèi)生菌的研究熱點［5－6］。

筆者從武漢豇豆種植區(qū)篩選出豇豆花內(nèi)生菌(whcfs1)，在豇豆花各花期花瓣中為優(yōu)勢內(nèi)生菌，可以在28～44℃生長。經(jīng)染色，鑒定為革蘭氏陽性，芽孢桿菌，16S rDNA擴增產(chǎn)物序列分析為巨大芽孢桿菌，可以分解淀粉，在豆莢中并未分離出此菌。該內(nèi)生芽孢桿菌有望成為豇豆基因工程益生菌、生防菌宿主菌株。

1 材料與方法

1．1 表面消毒處理 用燒杯取豇豆花沖洗表面污垢，移至無菌瓶中。用濃度0．1%升汞振蕩浸泡花3～4 min，用無菌水沖洗3～4遍，再用濃度75%酒精振蕩浸泡花3～4 min，無菌水沖洗5～6遍。

1．2 內(nèi)生菌的分離 將表面消毒處理后的花移至無菌研缽中，減碎，加入生理鹽水和石英砂，研磨，2 000 r/min離心10 min，取上清涂布于NA培養(yǎng)基平板，取等量最后一次水洗的無菌水作為空白對照。在30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)得到的單菌株做平板劃線，分離、提純并且保種。

1．3 革蘭氏染色 將菌液移至載玻片烘干、固定，結(jié)晶紫染色1 min，用革蘭氏碘液進行媒染1 min，酒精脫色，沖凈，番紅復(fù)染2 min，洗凈，用油鏡鏡檢。

1．4 芽孢染色 熱固定菌液，孔雀綠染色液加熱染色4～5 min，番紅復(fù)染，洗凈，用油鏡鏡檢。

1．5 細(xì)菌基因組抽提 細(xì)菌用沸水煮10 min，3 000 r/min離心10 min，取上清。

1．6 16Sr DNA擴增 采用16SrDNA通用引物為27F，5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R，5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

1．7 聚合酶鏈擴增反應(yīng) 利用特異性檢測引物，對提取的基因組進行PCR。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s循環(huán)30次，72℃10 min。

1．8 序列分析 16SrDNA測序結(jié)果經(jīng)過Blast在Genebank中搜索相似序列，并且通過多序列對比軟件clustal分析，得到該菌種屬情況。

1．9 生長溫度范圍摸索 菌落涂于LB固體平板，在不同溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，記錄菌落生長情況。

1．10 糖/酸發(fā)酵試驗 分別接種于糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，另外保留一支不接種的培養(yǎng)基為對照。

1．11 硫化氫產(chǎn)生試驗 取檸檬酸鐵鹽半固體培養(yǎng)基，穿刺接種，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，觀察。

1．12 V．P試驗 接種于葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中，置于37℃，培養(yǎng)24 h，觀察。在培養(yǎng)液中加入濃度40%KOH溶液10～20滴，然后加入等量的α-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃恒溫箱中保溫15～30 min，觀察。

1．13 吲哚試驗 接種于蛋白胨水培養(yǎng)液中，置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，觀察。觀察時，加入乙醚1 ml，充分振蕩，靜置待乙醚浮于上層時，沿管內(nèi)壁慢慢加入吲哚試劑10滴，觀察。

1．14 檸檬酸鹽利用試驗 接種檸檬酸鈉斜面，置于37℃，培養(yǎng)24～48 h，觀察。

1．15 淀粉水解試驗 接種于淀粉培養(yǎng)基涂平板，于37℃恒溫箱，培養(yǎng)16 h，觀察。

1．16 油脂水解試驗 劃線于油脂培養(yǎng)基(花生油)上，于37℃恒溫箱培養(yǎng)16、24 h，觀察。

2 結(jié)果與分析

2．1 革蘭氏染色 在革蘭氏染色后，油鏡下可以看到菌體為短桿狀(圖1)，為革蘭氏陽性菌。

1．2 芽孢染色 由圖2可知，在視野下可見紅色的桿菌和綠色的芽孢，為芽孢桿菌。

2．3 16Sr DNA測序結(jié)果 由圖3可知，該內(nèi)生菌為芽孢桿菌。從所構(gòu)建的16SrDNA基因進化樹上來看，它屬于巨大芽孢桿菌。

2．4 生理生化試驗結(jié)果 根據(jù)生化試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分離得到的芽孢桿菌不能進行糖發(fā)酵，不能產(chǎn)H2S，V．P試驗和吲哚試驗結(jié)果為陰性，不能利用檸檬酸，不能分解油脂，但可以分解淀粉。

2．5 菌落生長溫度范圍 在LB固體培養(yǎng)基中，菌體營養(yǎng)體可在23～49℃溫度范圍內(nèi)生長。

3 討論

植物內(nèi)生菌的研究是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)微生物學(xué)的研究熱點。由于起步較晚，很多領(lǐng)域還有待研究，目前在豇豆中分離內(nèi)生菌的報道仍是空白。該試驗分離得到一株豇豆花的內(nèi)生巨大芽孢桿菌。它可以在豇豆花中定殖，在各期花中屬于優(yōu)勢菌株，但在豆莢、豆、葉片和根系中沒有分離到。該內(nèi)生菌生長溫度范圍寬，營養(yǎng)體可在23～49℃溫度范圍內(nèi)生長，更適合武漢地區(qū)豇豆開花、結(jié)莢的夏秋兩季。16S rDNA測序結(jié)果顯示，該內(nèi)生菌為巨大芽孢桿菌。生理生化試驗表明，該菌符合巨大芽孢桿菌的生化特征。研究表明，巨大芽孢桿菌具有解磷固鉀的功能，可用于生產(chǎn)有機肥，是植物良好的益生菌菌株［7－8］;此外，分離得到的豇豆花內(nèi)生芽孢桿菌可在豇豆花中定植生長，同時可作為豇豆基因工程益生菌或基因工程生防菌的理想宿主菌株。

［1］徐玲玲，單慶紅，郭斌．植物內(nèi)生菌研究進展及應(yīng)用展望［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(13):5641 －5643．

［2］楊威．細(xì)菌定殖能力與其生物防治功能相關(guān)性研究進展［J］．中國生物防治，2010，26(S1):90 －94．

［3］BABALOLA O O．Beneficial bacteria of agricultural importance［J］．Biotechnol lett，2010，32(11):1559 －1570．

［4］SOLTERL E，MADDOX JV，VOSSBRINCK CR．Physiological host specificity:A model using the European corn borer，Ostrinia nubilalis(Hübner)(Lepidoptera:Crambidae)and microsporidia of row crop and other stalk － boring hosts［J］．J Invertebr Pathol，2005，90(2):127 －130．

［5］劉峰，蔣宇揚，劉世英．植物內(nèi)生菌抗蟲工程研究進展［J］．生物技術(shù)通訊，2004，15(4):417 －420．

［6］陳澤斌，靳松，張永福．物內(nèi)生菌生物防治研究進展及存在的問題［J］．昆明學(xué)院學(xué)報，2014，36(3):40 －42．

［7］SPINOSAM R，BRACCINIT，RICCAE，et al．On the fate of ingested Bacillus spores［J］．Research in microbiology，2000，151:361 －368．

［8］呂黎，王蕾，周佳敏．巨大芽孢桿菌的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用［J］．農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2014，35(3):48 －51．